背景：

      支原體(tǐ)（Mycoplasma）是對支原體(tǐ)科(kē)、無膽甾原體(tǐ)科(kē)和螺原體(tǐ)科(kē)的原核微生物(wù)總稱，是已知可(kě)以自由生活的最小(xiǎo)生物(wù)，沒有(yǒu)細胞壁，形狀多(duō)樣可(kě)變，直徑一般是0.1~0.3μm，基因組A-T 含量高，對常見的抗生素不敏感，對熱敏感。目前已從污水、植物(wù)、動物(wù)、禽類、昆蟲、人、溫泉或其他(tā)高溫環境中(zhōng)發現200 種左右支原體(tǐ)。細胞如果受到支原體(tǐ)污染，細胞生長(cháng)速度變慢，細胞産(chǎn)生病變或形态改變。連續培養細胞污染的概率大約15~35%，主要來源于20 多(duō)種支原體(tǐ)，包括口腔支原體(tǐ)（M.orale）、肺炎支原體(tǐ)（M.pneumoniae）、發酵支原體(tǐ)（M.fermentans）、精(jīng)氨酸支原（M.arginini）、萊氏無膽甾原體(tǐ)（A.laidlawii）和豬鼻支原體(tǐ)（M.hyorhinis）。

      人員操作(zuò)、污染的細胞、原輔料（血清、胰酶、培養基），實驗環境污染（生物(wù)安(ān)全櫃、細胞間，培養箱）、實驗儀器（水浴鍋、液氮罐）、實驗耗材（培養皿、方瓶、細胞工(gōng)廠）都可(kě)能(néng)是污染源。污染了的細胞一方面對生産(chǎn)帶來巨大影響，另外如果細胞産(chǎn)品、蛋白産(chǎn)品、病毒類産(chǎn)品受到支原體(tǐ)污染，最終會給患者帶來潛在的健康風險。因此，監管部門要求企業對細胞庫，檢定用(yòng)細胞和産(chǎn)品進行支原體(tǐ)檢測，從源頭上進行控制，盡早發現，确保放行産(chǎn)品不含支原體(tǐ)。對此，全球各國(guó)藥物(wù)監管部門也發布了支原體(tǐ)檢測相關指南，檢測方法主要包括熒光染色法、培養法、生化檢測方法和核酸擴增法。

      上述檢測方法中(zhōng)，大多(duō)操作(zuò)步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高、不能(néng)區(qū)分(fēn)支原體(tǐ)種類、需要特殊儀器或所需時間較長(cháng)。而PCR法操作(zuò)相對比較簡單便捷，PCR擴增後通過電(diàn)泳分(fēn)析即可(kě)确定是否有(yǒu)支原體(tǐ)污染，并可(kě)根據擴增片段的大小(xiǎo)大緻預測至少11種所污染的支原體(tǐ)種屬，也可(kě)以對PCR産(chǎn)物(wù)進一步測序以确定具(jù)體(tǐ)的支原體(tǐ)種屬。

概述：

Rhinogen^® Myco-PCR^TM 支原體(tǐ)檢測試劑盒是一種通過巢式PCR法（Nested PCR）檢測培養細胞等生物(wù)材料中(zhōng)是否存在支原體(tǐ)污染的檢測試劑盒。本支原體(tǐ)檢測試劑盒是利用(yòng)兩對引物(wù)通過巢式PCR法特異性擴增支原體(tǐ)基因組DNA片段，從而實現對支原體(tǐ)的高靈敏度特異性檢測的。

圖1. Rhinogen^® Myco-PCR^TM 支原體(tǐ)檢測試劑盒的檢測原理(lǐ)圖

本試劑盒提供了PCR Mix（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Loading Buffer），擴增完畢後可(kě)以直接上樣電(diàn)泳，可(kě)快速、有(yǒu)效、高靈敏度地檢測支原體(tǐ)污染。配套的陽性對照，便于确定PCR檢測是否能(néng)正常工(gōng)作(zuò)及樣品中(zhōng)是否存在抑制PCR反應的物(wù)質(zhì)。原核生物(wù)的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)（space region）在各種生物(wù)種間的堿基序列差别很(hěn)大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個間隔區(qū)的DNA序列及長(cháng)度在支原體(tǐ)各個種屬間既有(yǒu)非常保守的部分(fēn)，也有(yǒu)較大差異的部分(fēn)。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設計一對F1/R1引物(wù)，用(yòng)于擴增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR（1st PCR），用(yòng)于初步鑒定是否有(yǒu)支原體(tǐ)污染；然後在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設計一條F2引物(wù)，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條R2引物(wù)進行巢式PCR的第二輪PCR（2nd PCR）。通過巢式PCR可(kě)以大大提高檢測的特異性和靈敏度。

應用(yòng)：

      本試劑盒确定可(kě)以擴增的支原體(tǐ)種類及1st PCR和2nd PCR擴增産(chǎn)物(wù)長(cháng)度參考如下表：

圖2. Rhinogen^® Myco-PCR^TM 支原體(tǐ)檢測試劑盒擴增産(chǎn)物(wù)的瓊脂糖凝膠電(diàn)泳示意圖

注：1）1、2、3是1st PCR産(chǎn)物(wù)，4、5、6是相應的2nd PCR産(chǎn)物(wù)；

       2）各泳道的模闆分(fēn)别是： 1和4：支原體(tǐ)污染的細胞上清；
                                               2和5：陽性對照；
                                               3和6：超純水；M：DNA marker。

      Rhinogen^® Myco-PCR^TM 支原體(tǐ)檢測試劑盒包裝(zhuāng)規格如下：

産(chǎn)品特性：

1.操作(zuò)簡單：試劑盒提供預混好的試劑，使體(tǐ)系配制操作(zuò)簡便；

2.快速檢出：通過PCR擴增及電(diàn)泳分(fēn)析進行支原體(tǐ)檢出隻需要數個小(xiǎo)時；

3.靈敏度高：PCR反應非常靈敏，可(kě)以擴增目的基因序列超過1000萬倍；

4.特異性高：使用(yòng)巢式PCR反應，提高了檢測特異性。

保存條件：

采用(yòng)冰袋運輸，收到産(chǎn)品後請立即置于-20℃及以下條件下儲存。本産(chǎn)品可(kě)耐受一定次數的凍融，但仍建議盡量避免多(duō)次反複凍融。