内毒素（化學(xué)上稱為(wèi)脂多(duō)糖或 LPS）是一種固定在革蘭氏陰性菌外膜上的成分(fēn)。它可(kě)以分(fēn)為(wèi)三部分(fēn)：暴露于外部環境的雜多(duō)糖O-抗原、具(jù)有(yǒu)胞内和胞外結構域的核心寡糖以及細胞膜下方的脂質(zhì)A。根據其化學(xué)結構，LPS 屬于兩親屬性。

内毒素分(fēn)子被脂質(zhì) A 錨定在細胞壁内，但會不斷釋放到周圍的培養基中(zhōng)，不僅在細胞死亡時，而且在其生長(cháng)和分(fēn)裂過程中(zhōng)也是如此。一旦内毒素進入血液循環，免疫細胞對其進行識别，就會導緻細胞内信号通路的快速激活，從而釋放血管活性肽和細胞因子等促炎介質(zhì)。上述過程可(kě)能(néng)導緻發熱、休克，甚至死亡。由于其在滅菌過程中(zhōng)對人體(tǐ)健康存在潛在危害且具(jù)有(yǒu)較高的化學(xué)穩定性，因此生物(wù)制品類、注射用(yòng)藥劑、抗生素類、疫苗等制劑以及醫(yī)療器材類必須經過細菌内毒素檢驗合格後才能(néng)使用(yòng)。

多(duō)年來，用(yòng)于檢測和量化内毒素的測試方法不斷發展，以提高其靈敏度。鲎變形細胞裂解物(wù) (LAL) 測定是内毒素檢測的藥典測試。該測定的試劑是來自鲎 (Limulus) 變形細胞裂解物(wù)的凍幹産(chǎn)物(wù)。除了 LAL 檢測外，Tachypleus（另一種鲎）變形細胞裂解物(wù) (TAL) 檢測也被批準用(yòng)于内毒素檢測。

此外，随着重組C因子内毒素檢測方案供應商(shāng)越來越多(duō)，法規也越來越明朗，因此被廣泛接受。其檢測原理(lǐ)更為(wèi)明确，原料可(kě)控，因此被用(yòng)于更為(wèi)準确的内毒素含量檢測，成為(wèi)傳統鲎試劑檢測的補充或替代方法。

無論哪種内毒素檢測方法，整個檢測體(tǐ)系正常工(gōng)作(zuò)的最重要的條件在于内毒素分(fēn)子本身、酶、檢測樣品屬性以及其他(tā)條件和諧共處，這些因素如果出現狀況都會導緻内毒素檢測産(chǎn)生抑制或增強作(zuò)用(yòng)，統稱幹擾，導緻結果不準确。

但是......不要怕，實驗前，做到知己知彼，方能(néng)百戰百勝！

我們來看看到底都有(yǒu)哪些會是内毒素檢測的幹擾因素。

首先，做實驗的時候不淡定是最大的幹擾因素，開個玩笑......

言歸正傳，真正的幹擾一般來源于如下幾個方面：

➤ 内毒素分(fēn)子本身是兩親性的分(fēn)子。兩親性導緻内毒素會在水相中(zhōng)聚集分(fēn)布，内部疏水，外部親水。文(wén)獻表明聚集體(tǐ)太大不利于内毒素活性顯現，單體(tǐ)分(fēn)布也不利于活性呈現。聚集-分(fēn)散是一個動态過程，受到二價金屬離子（Ca²⁺，Mg²⁺）和pH（H⁺）、非離子型去垢劑影響；

➤ 負電(diàn)荷基團（PO4^3-，糖基）在一定條件下也會和正電(diàn)荷位點或者陽離子相互結合。

➤ 低pH下，質(zhì)子會和二價陽離子競争，打破聚集體(tǐ)動态平衡；

➤ 二價金屬離子（Ca²⁺,Mg²⁺）促進鹽橋形成而促進LPS聚集，因此内毒素檢測會受到金屬離子螯合劑幹擾，EDTA有(yǒu)六個金屬離子配位點，因此幹擾最強，其次是檸檬酸；

➤ 由于去垢劑也有(yǒu)兩親性，可(kě)能(néng)會取代内毒素并形成占位效應，導緻聚集體(tǐ)組成變化形成幹擾，其中(zhōng)PS-20擴散比PS-80快，因此PS-20幹擾更大；

➤ 低溫下（2-8℃或-20℃）聚集體(tǐ)形成較慢，同時非離子型去垢劑占位形成内毒素-去垢劑複合體(tǐ)的速度也比較慢，因此幹擾會比較低；

➤ 過高濃度的鹽或糖溶液（如50%的葡萄糖或5%的氯化鈉溶液）通常會抑制試劑反應。因為(wèi)高滲透壓的溶液會從試劑吸水，從而使酶失活，造成抑制；

LPS聚集狀态動态圖（Johannes Reich et al., 2016）

➤ 正電(diàn)荷蛋白結合内毒素負電(diàn)荷位點。在陽離子蛋白溶菌酶、核糖核酸酶A 和人IgG樣品内毒素檢測中(zhōng)，發現了蛋白質(zhì)對内毒素的掩蓋，即使對樣品進行稀釋也無法解決。

➤ 蛋白和内毒素疏水相互作(zuò)用(yòng)，包裹内毒素導緻活性無法檢測

➤ pH值在6～8範圍酶活性最佳，因此樣品pH值盡量不能(néng)低于5不能(néng)高于9；

➤ 高濃度變性劑會使得蛋白（酶）變性，喪失活性；

➤ 如反應體(tǐ)系中(zhōng)有(yǒu)蛋白酶，也會因為(wèi)降解活性物(wù)質(zhì)，如C因子，導緻檢測受到幹擾，結果不準确；

➤ 絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制C因子底物(wù)酶切活性，幹擾檢測；

➤ 血清中(zhōng)複雜成份幹擾等；

➤ 疫苗領域常會遇到的氫氧化鋁佐劑吸附内毒素導緻檢測幹擾問題。

以上隻是把可(kě)能(néng)的幹擾條件列舉出來，我們真正在樣品内毒素檢測中(zhōng)，能(néng)夠同時遇到2個以上問題就算中(zhōng)獎了。所以，我們要做的事情是，在遇到幹擾的時候，理(lǐ)性分(fēn)析樣品屬性，看看可(kě)能(néng)會是什麽原因，然後對症下藥，便可(kě)解決。

下一期，我們再看看以上問題可(kě)以如何解決，敬請期待…….

[1] Rui xuan Bu, Xinren Deng, Yuan Cao.Effect of different sample treatment methods on Low Endotoxin Recovery Phenomenon, Journal of Microbiological Methods,Volume 186, July 2021, 106241.

[2] Yuan Cao. Low endotoxin recovery and its impact on endotoxin detection, Biopolymers, Volume112, Issue11 November 2021

[3] Johannes Reich, Pierre Lang. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems, Biologicals Volume 44, Issue 5, September 2016, Pages 417-422

[4] PDA Technical Report No. 82 (TR 82) Low Endotoxin Recovery, PDA, 2019.