臨床輸液反應以熱原反應危害最大，發生率最高。内毒素（即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多(duō)糖分(fēn)子，lipopolysaccharide，LPS）注射即使是pg級别的痕量LPS也會導緻病人嚴重的熱原反應，引起人體(tǐ)發熱、休克甚至死亡。因此，靈敏可(kě)靠的内毒素分(fēn)析技(jì )術是非常必須的。
目前細菌内毒素檢查主要依賴于鲎試劑，可(kě)分(fēn)為(wèi)凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。
内毒素的低回收率現象（Low Endotoxin Recovery,LER）是當前經常讨論的話題。内毒素低回收率是指對已經添加細菌内毒素标準品的生物(wù)制藥産(chǎn)品采用(yòng)藥典規定方法進行細菌内毒素檢查時加标内毒素檢出失敗的現象，而這種現象通常表現為(wèi)回收率過低，内毒素被掩蔽。如果“内毒素掩蔽”發生，意味着該内毒素的活性形式（超分(fēn)子結構）發生了變化，從而檢測到的值要比實際低。因加入細菌内毒素标準品的藥品内毒素回收失敗，生産(chǎn)過程中(zhōng)被内毒素污染的含熱原産(chǎn)品會因内毒素不能(néng)被檢出而被放行，導緻含熱原的産(chǎn)品因用(yòng)于商(shāng)業用(yòng)途而被患者使用(yòng)的風險仍舊存在。
2013年，FDA開始要求生物(wù)制品上市申請（Biologicslicensing applications，BLA）的申請人須提交在藥品中(zhōng)加入内毒素标準品後，使用(yòng)USP規定的細菌内毒素檢查方法可(kě)以檢出藥品中(zhōng)預加入的細菌内毒素。在BLAs中(zhōng)關于内毒素加标試驗及内毒素保持時間的研究遇到了很(hěn)大難點，這推動FDA需要獲取更多(duō)信息或額外的研究來說明。但是不同公(gōng)司和不同研究的spike/hold study存在明顯的差異。
加标樣品的細菌内毒素的檢出受樣品的制備方法影響（包括預處理(lǐ)及渦旋時間等），同時細菌内毒素标準品的類型、細菌内毒素标準品的加入量、保持時間、被加标樣品的溫度、内毒素回收率的計算方式、檢查的執行等均可(kě)引起測試結果的明顯差異，這增加了對結果進行比較和分(fēn)析難度。等電(diàn)點（Isoelectric points，pI)大于8或具(jù)有(yǒu)正電(diàn)結構的特定蛋白質(zhì)會束縛加入樣品中(zhōng)的内毒素标準品從而引起LER。
内毒素掩蔽是時間依賴性的，這意味着如果掩蔽發生，内毒素的回收率随時間降低。要降低低回收率現象，可(kě)以選擇具(jù)有(yǒu)足夠高濃度的樣品，然後進行稀釋從而排除或減少幹擾。
此外，除了回收率低這一現象，内毒素檢測中(zhōng)也存在假陽性這一問題。這主要是因為(wèi)除了内毒素，内毒素檢測所用(yòng)的鲎試劑還與某些β-葡聚糖反應，産(chǎn)生假陽性結果。科(kē)學(xué)研究表明，含有(yǒu)高濃度蛋白質(zhì)和聚山(shān)梨酯等非離子型表面活性劑的生物(wù)制劑結合使用(yòng)後，往往會改變内毒素分(fēn)析物(wù)的聚集态，以至于内毒素的檢測存在問題。
鲎試劑是從鲎的血液中(zhōng)提取出的凍幹試劑，可(kě)以與細菌内毒素發生凝集反應。2021年2月5日，《國(guó)家重點保護野生動物(wù)名(míng)錄》将我國(guó)分(fēn)布的鲎科(kē)動物(wù)（中(zhōng)國(guó)鲎、圓尾蠍鲎）升級為(wèi)國(guó)家二級保護動物(wù)。這無疑對依賴鲎試劑的内毒素檢測造成了影響。
2020版中(zhōng)國(guó)藥典《9251細菌内毒素檢查法應用(yòng)指導原則》提出，可(kě)使用(yòng)重組C因子法進行内毒素檢測。
重組C因子（rFC）内毒素檢測是一種不依賴于動物(wù)源性成分(fēn)、靈敏度高、特異性高、可(kě)穩定且持續提供的替代鲎試劑的内毒素測定方法。
C因子是傳統鲎試劑中(zhōng)對細菌内毒素敏感的蛋白，能(néng)夠選擇性地識别内毒素。重組C因子利用(yòng)基因重組技(jì )術表達的内毒素特異性酶，被活化後可(kě)直接與熒光底物(wù)作(zuò)用(yòng)，産(chǎn)生與内毒素濃度成正比的熒光信号，從而實現定量。相對于傳統鲎試劑，重組C因子法可(kě)以為(wèi)我們帶來以下優點：
1、保護鲎資源
rFC方法無動物(wù)源，保護了鲎資源，也符合現在3R保護理(lǐ)論，即對使用(yòng)實驗動物(wù)的實驗應替代、減少、優化。
2、避免β-葡聚糖的幹擾
傳統鲎試劑檢測方法由于存在旁路反應（鲎試劑中(zhōng)的G因子在β-葡聚糖存在下也可(kě)以引起反應），會造成假陽性。而重組C因子方法從原理(lǐ)上就避免了這種幹擾。
3、标準化
鲎血是個複雜的成分(fēn)，不同個體(tǐ)、不同時間、地點采集的鲎血都會有(yǒu)所不同，這就造成了鲎試劑存在一定的批次間波動。而重組C因子方法由于其可(kě)控的生産(chǎn)工(gōng)藝，可(kě)以保證其批間穩定性。使企業實現标準化檢測。
4、持續穩定供給
對于内毒素檢測的需求在急劇增加，但是鲎資源卻在急劇緊縮。這種供需關系也為(wèi)鲎試劑的使用(yòng)帶來的很(hěn)大風險。重組C因子法基于其可(kě)無限重複的生産(chǎn)工(gōng)藝，可(kě)以保證持續穩定的供給。
2018年，FDA批準了基于rFC試劑進行内毒素檢測的藥物(wù)。這為(wèi)rFC檢測方法的廣泛采用(yòng)打開了大門。作(zuò)為(wèi)一種合成試劑，rFC可(kě)以替代來源于鲎血液的美洲鲎試劑（LAL）和東方鲎試劑（TAL）用(yòng)于内毒素檢測。rFC試劑的主要優點是提高了一緻性和可(kě)持續性。變異是所有(yǒu)動物(wù)源性産(chǎn)品的共同特征，合成的一緻性可(kě)以使生産(chǎn)和檢測過程更容易控制，并且由于可(kě)以無限制地的生産(chǎn)rFC，從而更具(jù)可(kě)持續性。
參考文(wén)獻
[1]Johannes Reich, Felix Alexander Weyer, HiroshiTamura, Isao Nagaoka and Hubert Motschmann. Low Endotoxin Recovery—Maskingof Naturally Occurring Endotoxin. Int J Mol Sci. 2019 Feb; 20(4): 838. doi:10.3390/ijms20040838.
[2]李京華,邵英光,嶽麗娜&王俊德(dé).(2006).動态比濁法定量測定内毒素的标準曲線(xiàn)斜率與回收率的關系.藥物(wù)分(fēn)析雜志(zhì),26(7),4.