細菌内毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多(duō)糖（LPS）和微量蛋白的複合物(wù)，它不是細菌或細菌的代謝(xiè)産(chǎn)物(wù)，而是細菌死亡解體(tǐ)後才釋放出來的一種具(jù)有(yǒu)内毒素生物(wù)活性的物(wù)質(zhì)。其化學(xué)成分(fēn)主要是由O-特異性鏈、核心多(duō)糖、類脂A三部分(fēn)組成，分(fēn)子量因來源不同從幾千到幾萬，締合物(wù)可(kě)達400,000-1,000,000。
内毒素對機體(tǐ)可(kě)産(chǎn)生緻病作(zuò)用(yòng)。它作(zuò)為(wèi)外源性緻熱原作(zuò)用(yòng)于細胞，使之釋放内源性緻熱原，引起發熱。并可(kě)激活血管活性物(wù)質(zhì)的釋放，使末梢血管擴張，通透性增高，靜脈回流減少，心排血量減低，導緻低血壓并發休克，或因組織供血不足缺氧，導緻代謝(xiè)性酸中(zhōng)毒。另一方面，它可(kě)發揮諸多(duō)對機體(tǐ)有(yǒu)益的生物(wù)學(xué)活性。适量的内毒素可(kě)增強機體(tǐ)非特異性免疫的作(zuò)用(yòng)，能(néng)夠抗感染、抗輻射，并能(néng)增強網狀内皮細胞的活力，并具(jù)有(yǒu)使腫瘤壞死消退的活性。
現有(yǒu)細菌内毒素的檢測方法包括家兔熱原試驗法、鲎試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯免疫法等。《中(zhōng)華人民(mín)共和國(guó)藥典》（2020版）規定細菌内毒素的檢測可(kě)采用(yòng)鲎試劑檢測法，為(wèi)适應特殊品種細菌内毒素檢查的需要，或減少鲎試劑的使用(yòng)量，可(kě)采用(yòng)重組C因子法或微量凝膠法等。
細菌内毒素檢測受多(duō)種因素影響，包括但不限于PH、溫度、螯合劑等。隻有(yǒu)很(hěn)少的樣品沒有(yǒu)幹擾可(kě)直接進行檢測，但是大約90%以上的幹擾因素，可(kě)通過簡單的處理(lǐ)，如不同程度的樣品稀釋消除幹擾。
内毒素檢測的反應是一個複雜的酶促反應，因此其反應的介質(zhì)要求有(yǒu)合适的pH，最佳pH範圍為(wèi)6-8。為(wèi)保證反應時合适的pH，檢測試劑必須具(jù)有(yǒu)一定的pH 緩沖能(néng)力。但有(yǒu)些檢品本身要求在酸性或堿性的介質(zhì)中(zhōng)保存，且自身也具(jù)有(yǒu)一定的pH緩沖能(néng)力，對這類檢品進行細菌内毒素檢查時，檢測試劑的pH 緩沖能(néng)力就不足以使反應介質(zhì)的pH緩沖到最佳範圍，會使反應受到幹擾，通常表現為(wèi)抑制作(zuò)用(yòng)。
内毒素是一個具(jù)有(yǒu)親水、疏水兩個區(qū)域的兩性分(fēn)子，這種結構使内毒素分(fēn)子間或内毒素分(fēn)子與檢品中(zhōng)成分(fēn)結合形成微室，内毒素的分(fēn)散性是由脂質(zhì)A形成高分(fēn)子聚合物(wù)的功能(néng)和多(duō)糖與陽離子靜電(diàn)引力決定的，當内毒素分(fēn)子的聚集增加，内毒素的反應性和熱原性都顯著下降，通常檢品中(zhōng)離子強度的較大提高會引起内毒素的聚集和回收率降低。
内毒素稀釋液貯存一段時間後會被破壞而失活，即使經充分(fēn)的旋渦混合也不能(néng)恢複，其中(zhōng)可(kě)能(néng)有(yǒu)多(duō)種幹擾因素，但容器效應是其中(zhōng)一個因素。容器效應與接内毒素稀釋液的容器材質(zhì)有(yǒu)關，主要表現管壁對内毒素的吸附，聚丙烯材質(zhì)還會對脂多(duō)糖複合物(wù)産(chǎn)生深度抑制。另外稀釋管洗滌後殘留的洗滌劑，也會形成微室，影響内毒素的分(fēn)散。
二價離子對内毒素分(fēn)散起着重要作(zuò)用(yòng)，Ca2＋、Mg2＋離子濃度的不适宜會引起抑制或增強反應。許多(duō)原因都會引起二價離子的不充足，從而抑制内毒素檢測試劑與内毒素反應的能(néng)力。
内毒素檢測是基于一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大作(zuò)用(yòng)産(chǎn)生的，絲氨酸蛋白酶可(kě)以被氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或專一失活劑所滅活，這些都會引起抑制，乙醇和苯酚對蛋白質(zhì)有(yǒu)變性作(zuò)用(yòng)，因而要限制其在樣品中(zhōng)的含量。
鲎試劑與内毒素和葡聚糖可(kě)以共同反應，且存在内毒素與葡聚糖共同作(zuò)用(yòng)時，鲎試劑的凝膠反應比對單一物(wù)質(zhì)作(zuò)用(yòng)更迅速、更劇烈。因此可(kě)采用(yòng)重組C因子法進行檢測，規避葡聚糖引起的幹擾。
1、加熱滅活
對由于蛋白質(zhì)或酶的修飾而表現的抑制作(zuò)用(yòng)或導緻内毒素檢測試劑變化的藥物(wù)本身是蛋白酶類，可(kě)通過加熱滅活處理(lǐ)來消除幹擾，或使用(yòng)超濾薄膜法去除。
可(kě)以通過稀釋樣品後避免樣品對于内毒素檢測反應的幹擾，應注意，有(yǒu)些樣品若堿性較強，單純的稀釋是不能(néng)排除幹擾的，必須經過調節樣品的pH後再稀釋，才能(néng)排除幹擾。
内毒素稀釋管應該是高質(zhì)量硼矽酸鹽玻璃材質(zhì)，以避免内毒素吸附于試管壁。不可(kě)使用(yòng)塑料用(yòng)具(jù)，因其伴随很(hěn)多(duō)未知的幹擾因素。同時避免使用(yòng)聚丙烯試管，因為(wèi)由聚丙烯材料制成的試管對内毒素的吸附也被公(gōng)認為(wèi)是幹擾内毒素檢查方法的因素之一。
通常采用(yòng)三種方法調節内毒素待檢樣品的pH。①使用(yòng)高靈敏度的檢測試劑，使得檢品的最大稀釋倍數（MVD）增大，從而減弱或消除檢品的pH因素對檢查的幹擾。②用(yòng)緩沖液制備樣品稀釋液，使檢品的pH達到适合反應的範圍。③用(yòng)酸、堿或緩沖液來調節pH。
最好的消除因絡合作(zuò)用(yòng)而導緻離子不足的方法是計算二價離子需要量，然後補充等摩爾無熱原的二價離子鹽。但常用(yòng)的方法是通過稀釋來消除絡合作(zuò)用(yòng)。
重組C因子法是傳統細菌内毒素檢查法的一種改良方法, 具(jù)有(yǒu)細菌内毒素檢查法的全部優點。與細菌内毒素檢查法比較, 還克服了使用(yòng)動物(wù)來源材料這一缺點, 實驗材料為(wèi)重組産(chǎn)生, 不受鲎資源限制；并且具(jù)有(yǒu)更強的抗幹擾能(néng)力和專屬性。重組C因子是由東方鲎或者美洲鲎的基因克隆而成，具(jù)有(yǒu)與C因子一樣的生理(lǐ)活性。其原理(lǐ)是使用(yòng)單一的蛋白質(zhì)C因子作(zuò)為(wèi)活性成分(fēn)參與反應，被内毒素活化的C因子将人工(gōng)合成的三肽鏈熒光底物(wù)裂解，産(chǎn)生熒光複合物(wù)在380nm～460nm檢測，通過定量檢測熒光複合物(wù)來量化細菌内毒素。其優點是因為(wèi)沒有(yǒu)B因子的存在，從而有(yǒu)效地避免了因G因子的旁路幹擾而産(chǎn)生的假陽性。
FDA在2012年發布的“内毒素與熱源檢測應用(yòng)指導原則-問與答(dá)”的“5.1有(yǒu)關替代方法”中(zhōng)明确重組C因子法按USP30-NF25<1225>驗證後，參照USP30-NF25<85>“細菌内毒素檢查法”進行實驗，可(kě)用(yòng)于産(chǎn)品申報，在産(chǎn)品放行中(zhōng)可(kě)以使用(yòng)該方法來控制内毒素污染。并于2018年9月批準重組C因子法用(yòng)于Eli Lilly的偏頭痛藥品Galcanezumab的最終産(chǎn)品的細菌内毒素檢測及産(chǎn)品放行。
多(duō)家國(guó)際知名(míng)藥企針對基于重組C因子的檢查方法與基于鲎試劑的檢查方法的比較，其結果表明兩種方法都足以用(yòng)于測試和發布多(duō)種産(chǎn)品，特别是對于含有(yǒu)葡聚糖的産(chǎn)品重組C因子的檢查方法更為(wèi)合适，在按照藥典要求得到充分(fēn)驗證後，可(kě)以考慮将其作(zuò)為(wèi)合适的替代方法，用(yòng)于檢測藥品生産(chǎn)過程中(zhōng)的内毒素。
目前重組C因子法已陸續被歐洲藥典和中(zhōng)國(guó)藥典收錄，作(zuò)為(wèi)不依賴動物(wù)鲎來源的可(kě)替代的内毒素檢測方法将是大勢所趨。
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