目的    建立氫氧化鋁佐劑細菌内毒素的重組C因子檢測方法。

方法   參照中(zhōng)國(guó)藥典2020年版四部載錄的重組C因子法，通過靈敏度試驗、标準曲線(xiàn)可(kě)靠性驗證、稀釋法排除幹擾、重複試驗，建立氫氧化鋁佐劑的内毒素定量檢測方法。

結果   通過靈敏度試驗，篩選出合适的96孔反應微闆。标準曲線(xiàn)可(kě)靠性驗證試驗檢測3批試劑，決定系數均大于0.980。幹擾試驗中(zhōng)通過稀釋法排除氫氧化鋁對檢測的幹擾。對Alhydrogel® 2％、國(guó)藥中(zhōng)生生物(wù)技(jì )術研究院生産(chǎn)的氫氧化鋁佐劑進行3次重複試驗，未檢測到内毒素。檢測這兩個生産(chǎn)廠家的氫氧化鋁佐劑共13批，回收率均在50％～200％範圍内，結果符合中(zhōng)國(guó)藥典規定。

結論  重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑具(jù)有(yǒu)良好的靈敏度、可(kě)靠性、重複性及抗幹擾能(néng)力，可(kě)應用(yòng)于氫氧化鋁佐劑的細菌内毒素檢測。

      鋁佐劑已廣泛應用(yòng)于人用(yòng)疫苗80餘年，其安(ān)全性和有(yǒu)效性均得到了充分(fēn)驗證。Alhydrogel®佐劑是目前國(guó)際公(gōng)認的标準氫氧化鋁佐劑[1-3]。中(zhōng)國(guó)藥典2020年版四部（藥典四部）對于氫氧化鋁佐劑内毒素含量有(yǒu)明确要求，應小(xiǎo)于每毫克鋁5 内毒素單位（endotoxin unit，EU）[4]。各種鋁佐劑和含鋁佐劑疫苗的制備過程不一，鋁離子及其膠體(tǐ)特性對一些檢測方法有(yǒu)幹擾，因此在建立細菌内毒素檢查方法的過程中(zhōng)需進行方法适用(yòng)性考察[5-7]。

      C因子為(wèi)激活鲎試劑凝固級聯反應時的第1個組分(fēn)，可(kě)選擇性識别細菌内毒素。重組C因子法采用(yòng)人工(gōng)表達的C因子，無需鲎原料，同時具(jù)有(yǒu)靈敏度高、抗幹擾能(néng)力強、高通量、可(kě)定量檢測等優點[8-10]，2013、2020、2021年先後被美國(guó)、中(zhōng)國(guó)、歐洲藥品監管部門接受為(wèi)内毒素檢查法[4, 11-12]。本研究采用(yòng)國(guó)産(chǎn)試劑，探索重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑細菌内毒素方法及幹擾情況，建立檢測方法。

      進口Alhydrogel® 2％氫氧化鋁佐劑購(gòu)自丹麥Brenntag Biosector公(gōng)司，鋁含量10 mg/ml，尚未建立鲎試劑凝膠檢測内毒素方法，生産(chǎn)廠家采用(yòng)的熱原檢查法為(wèi)家兔法，參照藥典四部要求，合格标準為(wèi)50 EU/ml；國(guó)産(chǎn)氫氧化鋁佐劑由國(guó)藥中(zhōng)生生物(wù)技(jì )術研究院有(yǒu)限公(gōng)司第六研究室提供，經鲎試劑凝膠法檢測細菌内毒素合格，參照藥典四部要求，合格标準為(wèi)3 EU/ml。

      3批重組C因子内毒素檢測試劑盒購(gòu)自蘇州瑞安(ān)生物(wù)科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司，批号分(fēn)别為(wèi)RF010201203、RF010210402、RF010210403。

        用(yòng)内毒素檢查用(yòng)水将試劑盒中(zhōng)内毒素工(gōng)作(zuò)标準品進行系列稀釋，加入微闆，100 μl/孔，每個濃度設2~6個複孔，37 ℃孵育15 min。将熒光底物(wù)、緩沖液、重組C 因子酶按5∶4∶1混合，加入微闆中(zhōng)，100 μl/孔，振蕩15 s，37 ℃孵育，于0和1 h時用(yòng)熒光微闆檢測系統讀數。計算每孔在0和1 h時相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）之差的對數lgΔRFU。

1.4.1 靈敏度驗證    配制濃度為(wèi)0.5 EU/ml的内毒素工(gōng)作(zuò)标準溶液，設6個複孔。設置儀器參數：激發、發射波長(cháng)380 nm和440 nm，溫度37 ℃，2次讀數之間間隔1 h，光學(xué)位置為(wèi)頂部，儀器增益值為(wèi)自動。結果判斷标準：lgΔRFU均值在3.5~4.0。選取3種96孔反應微闆進行試驗。

1.4.2 标準曲線(xiàn)可(kě)靠性驗證    采用(yòng)3批内毒素檢測試劑盒，分(fēn)别配制濃度為(wèi)5×10^-3~5×10⁰ EU/ml的内毒素工(gōng)作(zuò)标準溶液，陰性對照為(wèi)内毒素檢查用(yòng)水。每個濃度的内毒素工(gōng)作(zuò)标準溶液和陰性對照做3個複孔。完成後按公(gōng)式計算每孔的lgΔRFU，标準品和樣品與陰性對照孔的 ΔRFU 之差為(wèi)淨 ΔRFU值，以淨 ΔRFU對數對内毒素濃度對數進行線(xiàn)性拟合，标準曲線(xiàn)精(jīng)密度要求：決定系數（R²）應大于等于0.980。

1.4.3 幹擾試驗    每次試驗均按1.4.2方法作(zuò)标準曲線(xiàn)。在供試品陽性對照中(zhōng)添加0.5 EU/ml的内毒素工(gōng)作(zuò)标準溶液。供試品采用(yòng)不同稀釋濃度以排除幹擾。每個試驗做2複孔，進行幹擾試驗研究。計算樣品及加标樣品的内毒素濃度，按下列公(gōng)式計算加标回收率，若加标回收率在 50%~200%之間則認為(wèi)樣品對檢測無幹擾，結果可(kě)靠。

1.4.4 重複試驗    按1.4.3方法将進口、國(guó)産(chǎn)氫氧化鋁佐劑分(fēn)别稀釋4 000、400倍，進行3次重複試驗，作(zuò)标準曲線(xiàn)，計算樣品及加标樣品的内毒素濃度、加标回收率。

1.4.5 細菌内毒素檢測    采用(yòng)進口、國(guó)産(chǎn)氫氧化鋁佐劑共13批，均按1.4.4項方法分(fēn)别稀釋4 000、400倍，作(zuò)标準曲線(xiàn)，計算樣品及加标樣品的内毒素濃度、加标回收率。當标準曲線(xiàn)R2≥0.980、樣品加标回收率在 50%~200%之間、内毒素濃度分(fēn)别低于50和3 EU/ml時，判定内毒素檢測合格。

     貨号966、6005181的微闆lgΔRFU值分(fēn)别為(wèi)2.63、3.19，不滿足靈敏度驗證的要求（3.5~4.0）。貨号136101的微闆lgΔRFU值為(wèi)3.58，可(kě)用(yòng)于檢測。

       取陰性對照、4個濃度工(gōng)作(zuò)标準品做3複孔，内毒素濃度在5×10^-3~5×10⁰  EU/ml時，标準曲線(xiàn)R²為(wèi)0.999，線(xiàn)性良好（圖1）。    

        對3批重組Ｃ因子試劑進行标準曲線(xiàn)可(kě)靠性驗證，R²分(fēn)别為(wèi)0.999、0.982、0.996，均大于等于0.980（圖2）。結果證明試劑、試驗條件可(kě)靠。

        重組C因子法26次試驗R²均在0.980以上，均值為(wèi)0.996，具(jù)有(yǒu)良好的精(jīng)密度。

      進口氫氧化鋁佐劑在10、100、1 000、2 000倍稀釋後，加标回收率為(wèi)0.0%、0.0%、2.2%、7.6%，表明存在抑制作(zuò)用(yòng)，即存在幹擾。在4 000倍稀釋後，加标回收率為(wèi)64.4%，排除了幹擾。國(guó)産(chǎn)氫氧化鋁佐劑在10、100、200倍稀釋後，加标回收率為(wèi)0.0%、0.0%、23.6%，表明存在抑制作(zuò)用(yòng)，即存在幹擾。在400倍稀釋後，加标回收率為(wèi)55.0%，排除了幹擾（表1）。

       進口、國(guó)産(chǎn)氫氧化鋁佐劑分(fēn)别稀釋4 000、400倍，進行3次重複試驗。标準曲線(xiàn)可(kě)靠性符合要求；樣品加标回收率均在50％～200％範圍内，無幹擾；内毒素定量檢測結果低于限值，根據藥典四部可(kě)判定合格。結果重複性良好（表2）。

      内毒素檢測結果見表3，檢測2個廠家的氫氧化鋁共13批，标準曲線(xiàn)可(kě)靠性符合要求，樣品的加标回收率均在50％～200％範圍内，無幹擾，細菌内毒素定量檢測值均低于合格标準，可(kě)判定合格，符合藥典四部規定。表明所建立的排除幹擾方法可(kě)用(yòng)于重組C因子法檢測，且重複、适用(yòng)性良好，可(kě)用(yòng)于氫氧化鋁佐劑日常質(zhì)量控制。

       本試驗根據藥典四部“細菌内毒素檢查法應用(yòng)指導原則” [9]，并參照相關文(wén)獻[13-14]，對重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑内毒素進行方法适用(yòng)性研究，結果顯示靈敏度、可(kě)靠性、精(jīng)密度、重複性良好。試驗中(zhōng)發現用(yòng)于熒光檢測的96孔反應微闆除滿足無菌、無熱原等要求外，還需進行驗證篩選。歐洲藥典中(zhōng)要求對每批重組Ｃ因子試劑均需進行标準曲線(xiàn)可(kě)靠性驗證，其亦是各國(guó)藥典中(zhōng)規定的方法轉移驗證，用(yòng)以證明該實驗室可(kě)以操作(zuò)重組Ｃ因子法[9-11]。按藥典四部要求，标準曲線(xiàn)R2應大于等于0.980，驗證3批重組Ｃ因子試劑的R2均大于0.980，證明試劑、試驗條件可(kě)靠。

       重組Ｃ因子法因采用(yòng)了熒光反應，不能(néng)直接使用(yòng)其他(tā)方法幹擾試驗的結論，加之生物(wù)制品的成分(fēn)複雜，不同品種的供試品必須進行幹擾試驗。通過重組C因子法檢測不同稀釋倍數的氫氧化鋁佐劑，排除了氫氧化鋁自身性質(zhì)引起的幹擾，并通過重複試驗及對13批氫氧化鋁佐劑的檢測建立具(jù)體(tǐ)檢測方法，解決了氫氧化鋁佐劑采用(yòng)鲎試劑凝膠法檢測有(yǒu)幹擾的問題^[15]。

      重組C因子法采用(yòng)儀器定量檢測，每次試驗均可(kě)定量觀察到樣品的幹擾或增強情況，隻需對3批新(xīn)産(chǎn)品進行試驗，根據結果即可(kě)快速建立方法。其高通量、快速的特性也更适用(yòng)于檢測生物(wù)制品成分(fēn)複雜的原料、半成品、成品，滿足研發、生産(chǎn)疫苗快速、準确的需求。本研究表明重組C因子法适用(yòng)于氫氧化鋁佐劑的細菌内毒素檢測，值得進一步推廣應用(yòng)。

參考文(wén)獻（略）

龐宇  王菲  章孟學(xué)  馮帆  劉愛平  孫成金

國(guó)藥中(zhōng)生生物(wù)技(jì )術研究院有(yǒu)限公(gōng)司質(zhì)量檢定室，北京  101111

通信作(zuò)者：孫成金，

Email: schj1979@163.com

引用(yòng)本文(wén)：龐宇，王菲，章孟學(xué)，等. 重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑細菌内毒素的适用(yòng)性 [J]. 國(guó)際生物(wù)制品學(xué)雜志(zhì), 2022, 45(5): 257-260.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220210-00011