納米抗體(tǐ)（VHHs）因其可(kě)通過工(gōng)程改造直接在真核細胞和原核細胞中(zhōng)進行表達而成為(wèi)有(yǒu)吸引力的抗體(tǐ)形式。利用(yòng)噬菌體(tǐ)展示技(jì )術構建的免疫羊駝VHH庫，并從中(zhōng)篩選得到抗Fc VHHs，它們可(kě)以與人類抗體(tǐ)Fc段高親和力地結合。當用(yòng)于标記産(chǎn)生mAb的CHO細胞時，GFP融合的anti-human Fc VHH-GFP産(chǎn)生的FACS信号明顯強于AF488連接的抗IgG抗體(tǐ)。此外，基于抗Fc VHH-GFP标記的CHO細胞的分(fēn)選使高生産(chǎn)力的細胞系得以富集。相比傳統的動物(wù)來源熒光抗體(tǐ)，這種安(ān)全且具(jù)有(yǒu)成本效益的抗Fc VHH-GFP可(kě)用(yòng)于優化治療性mAb生産(chǎn)的高産(chǎn)細胞系的篩選過程。
高産(chǎn)細胞系的篩選和富集仍然是單克隆抗體(tǐ)（mAb）生産(chǎn)過程中(zhōng)面臨的巨大挑戰。傳統的有(yǒu)限稀釋法是成熟和可(kě)靠的，但它耗時長(cháng)，而且通量低。因此，一種高效和高通量的篩選方法就更加重要了。近年來，随着技(jì )術的發展，新(xīn)型的單細胞篩選方法已經被開發出來，以促進更有(yǒu)效地分(fēn)離高産(chǎn)的克隆細胞，如單細胞分(fēn)析和分(fēn)離系統，包括：
1）基于細胞表面顯示技(jì )術的無标簽篩選方法，微流控技(jì )術和Beacon平台；
2）利用(yòng)ClonePix™ Systems分(fēn)析生長(cháng)在半固體(tǐ)中(zhōng)的細胞，并通過克隆熒光顯微鏡進行挑選。
研究結果表明，分(fēn)泌的蛋白質(zhì)會被短暫截留在細胞表面，并且與細胞分(fēn)泌的蛋白質(zhì)的量相關，這為(wèi)使用(yòng)流式細胞儀和細胞分(fēn)選來分(fēn)離出稀有(yǒu)的高産(chǎn)細胞提供了啓發。熒光激活細胞分(fēn)選（FACS）根據測定的熒光水平對細胞進行篩選，已被證明是高效且有(yǒu)效的。然而，在篩選過程中(zhōng)使用(yòng)的抗IgG熒光抗體(tǐ)來自于動物(wù)源，導緻人們對生物(wù)制藥生産(chǎn)中(zhōng)的生物(wù)安(ān)全性産(chǎn)生擔憂。因此，尋求一種重組抗體(tǐ)用(yòng)于細胞标記，并從轉染的細胞系中(zhōng)選擇高産(chǎn)的亞克隆，顯得尤為(wèi)重要。研究表明，單鏈可(kě)變片段（scFv）和綠色熒光蛋白（GFP）的融合抗體(tǐ)可(kě)以在流式細胞儀中(zhōng)直接标記細胞，避免了抗原結合能(néng)力的喪失，減少了背景染色。與scFv相比，VHH在結構穩定性、分(fēn)子量、表達産(chǎn)量、DNA操作(zuò)和文(wén)庫構建的便利性方面具(jù)有(yǒu)更多(duō)優勢。
利用(yòng)VHH-GFP篩選出可(kě)高表達抗Her2 mAb的重組CHO細胞系。通過噬菌體(tǐ)展示技(jì )術篩選出抗Fc的VHH，以GFP融合标簽的形式在大腸杆菌中(zhōng)進行表達和生産(chǎn)。純化後的VHH-GFP可(kě)用(yòng)來标記CHO細胞，并以熒光強度為(wèi)标準分(fēn)離出高産(chǎn)細胞系。最後，檢測不同亞克隆中(zhōng)抗Her2 mAb的表達水平。通過與傳統的熒光抗體(tǐ)（Goat anti-human IgG(H+L) antibody, Alexa Fluor 488）的對比，評估VHH-GFP在分(fēn)選高産(chǎn)細胞系的可(kě)行性。
用(yòng)F. sight分(fēn)别對VHH-1-GFP或AF488标記的細胞進行分(fēn)選。VHH-1-GFP标記（圖1，B）的細胞系的熒光強度明顯高于AF488标記的傳統抗體(tǐ)（圖1A）的熒光強度。單個細胞系的熒光值對比展示在圖1C。
在分(fēn)選過程中(zhōng)，設置條件包括熒光強度最高的30%的細胞，并且大于12微米，圓度為(wèi)0.6∼1，以排除不能(néng)增殖的和不規則形狀的細胞。随後将分(fēn)選的細胞置于96孔闆中(zhōng)培養（1個細胞/孔），20天後通過ForteBio定量分(fēn)析抗Her2 mAb的表達情況。經VHH-1-GFP分(fēn)選的亞克隆的平均mAb濃度為(wèi)15.75 mg/L，最高值為(wèi)28 mg/L，而經AF488共轭山(shān)羊抗體(tǐ)篩選的亞克隆的平均值為(wèi)9.14 mg/L，最高值為(wèi)17.8 mg/L（圖2）。這些數據證實了VHH-1-GFP可(kě)用(yòng)于流式細胞儀分(fēn)選，并有(yǒu)效富集高mAb表達的CHO細胞。
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