報告基因法是将報告基因編碼的序列與基因表達序列融合或者與其他(tā)目的基因融合形成重組蛋白，通過報告基因産(chǎn)物(wù)的表達來顯示目的基因的表達調控。

基于熒光素酶的報告基因與β-半乳糖苷酶 (β-Gal)、葡萄糖醛酸酶 (GUS) 、綠色熒光蛋白 (GFP) 、分(fēn)泌型堿性磷酸酶 (SEAP) 報告基因具(jù)有(yǒu)獨特的優勢，它的優勢在于：

② 内源性低，哺乳動物(wù)無内源性表達和其檢測不受細胞内其他(tā)物(wù)質(zhì)影響的特點；

③ 無激發光的非特異性幹擾，信噪比較高；

④ 檢測範圍廣，大于7個數量級。

圖1。(A)，I型幹擾素在用(yòng)ISRE驅動的熒光素酶穩定轉染的HEK 293細胞中(zhōng)誘導熒光素酶表達。(B)，抗-IL-6/抗-IL-6R mAbs抑制用(yòng)SIE驅動的熒光素酶穩定轉染的DS-1細胞中(zhōng)IL-6誘導的熒光素酶表達。(C)，抗VEGF/抗VEGFR2 mAb抑制用(yòng)VEGFR2和NFAT響應性熒光素酶穩定轉染的HEK 293細胞中(zhōng)熒光素酶的表達。(D)，CHO細胞被膜錨定的抗CD3 scFv和PD-L1穩定轉染，而Jurkat細胞被PD-1和NFAT反應性熒光素酶穩定轉染。CHO細胞上的抗 CD3 scFv交聯并激活Jurkat細胞上的CD3，導緻NFAT控制的熒光素酶的表達，但CHO細胞上的PD-L1與Jurkat細胞上的PD-1相互作(zuò)用(yòng)，抑制熒光素酶的表達，而抗PD-1/anti-PD-L1 mAbs阻斷PD-1和PD-L1相互作(zuò)用(yòng)，導緻熒光素酶表達抑制的逆轉。(E)，Jukat細胞用(yòng)FcγRIIIa-FcεRIγ嵌合體(tǐ)和用(yòng)于mAb的ADCC的NFAT響應熒光素酶穩定轉染。腫瘤抗原之間的相互作(zuò)用(yòng)mAbs和Fab以及mAbs的Fc和嵌合體(tǐ)的胞外FcγRIIIa部分(fēn)有(yǒu)助于嵌合體(tǐ)的交聯，由嵌合體(tǐ)的胞内FcεRIγ部分(fēn)介導的信号轉導導緻NAFT控制的熒光素酶的表達。(F)，H322細胞用(yòng)與熒光素酶C端融合的Shc蛋白和與熒光素酶N端融合的Grb2蛋白穩定轉染用(yòng)于抗EGFR mAb。由EGF誘導的EGFR的激活、二聚化和磷酸化依次募集Shc和Grb2，并且這兩種蛋白質(zhì)的接近重構了熒光素酶，而抗EGFR mAbs消除了由EGF誘導的熒光素酶生物(wù)活性。

下面簡單介紹報告基因法檢測抗HER2單克隆抗體(tǐ)ADCC生物(wù)學(xué)活性的方法構建。

構建FcγRⅢ表達質(zhì)粒pcDNA3.1-hFcγRⅢa和報告基因質(zhì)粒pcDNA3.1-NFAT-RE-luc，并轉染Jurkat細胞，接種密度為(wèi)2.5×10⁵～4×10⁵個·mL^-1，2～3d傳代，最高細胞密度不應超過2×10⁶個·mL^-1；傳代培養基為(wèi)RPMI 1640+10%FBS。電(diàn)轉參數如下：電(diàn)轉體(tǐ)積為(wèi)100μL；細胞數目為(wèi)2×10⁶個·mL^-1；質(zhì)粒用(yòng)量為(wèi)10μg；電(diàn)轉條件為(wèi)1350V，10ms，3次。電(diàn)轉後的Jurkat細胞于6孔闆培養，每孔培養基為(wèi)2mL。

• 效應細胞株的篩選

轉染24h或48h後加入篩選壓力，以G418作(zuò)為(wèi)單轉pcDNA3.1-hFcγRⅢa的選擇壓力劑，篩選質(zhì)量濃度為(wèi)500μg·mL^-1；以嘌呤黴素作(zuò)為(wèi)單轉pcDNA3.1-NFAT-RE-luc的選擇壓力劑，篩選質(zhì)量濃度為(wèi)1.0μg·mL^-1；對于細胞表面的hFcγRⅢa分(fēn)子，采用(yòng)流式分(fēn)析的方法進行克隆鑒定和篩選。200g離心5min收集1×10⁵個細胞，以PBS洗滌1次，200g離心5min後，加入1μg·mL^-1FITC标記remicade，4℃孵育1h，再以PBS洗滌3次，每次200g離心5min，最後以200μL PBS重懸細胞進行流式檢測。通過NFAT通路激活因子PMA和離子黴素共刺激的方法檢測NFAT-RE-luc報告基因信号高的克隆，不同克隆每孔加入200μL含有(yǒu)0.1μmol·L^-1PMA和1μmol·L^-1離子黴素的細胞培養基(含10%FBS的RPMI 1640培養基)刺激過夜，以僅加200μL細胞培養基的細胞孔作(zuò)為(wèi)陰性對照進行熒光信号比較篩選。

• 靶細胞的選擇 

流式細胞術檢測人乳腺癌細胞系SKBR3、BT474及MCF7表面HER2表達量差異，經FlowJo7.2.5軟件分(fēn)析可(kě)知，這3株細胞表面HER2蛋白的表達量高低為(wèi)SKBR3>BT474>MCF7。ADCC試驗成功的重要條件之一就是特異的HER2+靶細胞，在這幾個HER2+細胞株中(zhōng)，SKBR3和BT474表面均高表達HER2抗原，明顯優于MCF7。

• 抗體(tǐ)濃度範圍選擇、效靶比的選擇、誘導時間的選擇

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基于保證劑量效應四參數曲線(xiàn)平台及保證誘導效果的考慮，最終選擇起始稀釋工(gōng)作(zuò)濃度為(wèi)4000ng·mL^-1，1∶4梯度稀釋作(zuò)為(wèi)檢測抗HER2單抗ADCC生物(wù)學(xué)活性時的試驗方案。從不同效靶比得到的不同ADCC試驗FI值并結合考慮EC50值，效靶比為(wèi)15∶1時能(néng)有(yǒu)效誘導ADCC活性并得到最大的FI值。ADCC誘導倍數随着不同誘導時間變化明顯，當誘導時間為(wèi)20和24h時可(kě)得到較大誘導倍數，考慮到工(gōng)作(zuò)效率等因素，選擇誘導時間為(wèi)20h。

• 方法應用(yòng)

以原研HER2單抗為(wèi)參比品，選取不同類型的抗HER2單抗1、單抗2，運用(yòng)選定的報告基因法，分(fēn)别進行ADCC活性測定。單抗1作(zuò)用(yòng)于HER2胞外的第2個結構域，主要通過阻斷HER2的二聚化發揮其抗腫瘤效應。單抗2是針對HER2靶點的新(xīn)型抗體(tǐ)-藥物(wù)偶聯物(wù)(antibody drug conjugates,ADC)，其不僅具(jù)有(yǒu)原研抗HER2單抗類似的生物(wù)學(xué)活性，還能(néng)通過其偶聯的化學(xué)藥物(wù)的釋放特異性地殺傷腫瘤細胞。從實驗結果看出，不同類型的HER2單抗在本實驗中(zhōng)均呈現較好的劑量效應曲線(xiàn)，說明本方法可(kě)應用(yòng)于不同類型HER2靶點單抗ADCC效應的檢測與比較。

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