細胞活性是指樣本群體(tǐ)中(zhōng)健康細胞所占的比例,受培養參數改變、藥物(wù)、生長(cháng)因子及各種疾病因素影響。例如,癌細胞活性增強,引起細胞異常增殖、逃避細胞凋亡;神經退行性疾病和其他(tā)組織退行性疾病則表現為(wèi)程序性細胞死亡;損傷和感染也會對細胞存活産(chǎn)生負面影響, 因此細胞活性檢測對于确認細胞生理(lǐ)狀态是必須的。
目前已經開發用(yòng)于不同實驗平台的多(duō)種細胞活性檢測技(jì )術。通常根據檢測原理(lǐ)可(kě)分(fēn)為(wèi)基于質(zhì)膜完整性和基于代謝(xiè)(如ATP代謝(xiè)和線(xiàn)粒體(tǐ)NADH)的檢測方法。
台盼藍,也稱二胺藍(Diamine Blue)和加拉藍(Niagra Blue), 是組織和細胞培養中(zhōng)最常用(yòng)的死細胞鑒定染料之一。活細胞細胞膜結構完整,能(néng)夠排斥台盼藍,細胞不被染色;通常認為(wèi)如果細胞膜喪失完整性,即是死細胞。死細胞的胞膜不完整,通透性增加,台盼藍可(kě)滲入并将細胞染成藍色。由此可(kě)以簡單、快速地區(qū)分(fēn)活細胞和死細胞。值得注意的是,如果長(cháng)時間染色,台盼藍可(kě)通過胞吞或胞飲作(zuò)用(yòng)進入細胞。因此染色時間不宜太長(cháng), 3~5分(fēn)鍾即可(kě),否則活細胞也會逐漸積累染料而染成顔色,使檢測結果偏低。
當兩種染料均存在于細胞核内,在合适的吖啶橙、碘化丙啶配比下,兩種染料發生能(néng)量共振轉移,死細胞在綠色通道下激發出紅色熒光。由于吖啶橙和碘化丙啶為(wèi)DNA結合染料,因此可(kě)有(yǒu)效排除雜質(zhì)以及紅細胞的幹擾,确保對樣品進行準确計數。
羟基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可(kě)穿透細胞膜的熒光染料,CFSE進入細胞後,可(kě)以不可(kě)逆地與細胞内的氨基結合,偶聯到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分(fēn)裂時,CFSE标記熒光可(kě)平均分(fēn)配至兩個子代細胞中(zhōng),因此其熒光強度是親代細胞的一半。在一個增殖的細胞群中(zhōng),各連續代細胞的熒光強度呈對半遞減,利用(yòng)流式細胞儀在488nm激發波長(cháng)和516nm檢測波長(cháng)進行分(fēn)析。常用(yòng)于淋巴細胞的增殖檢測,也可(kě)以用(yòng)于成纖維細胞、NK細胞等其它細胞的增殖檢測,甚至還可(kě)以用(yòng)于細菌增殖的檢測。
MTT比色法,是一種可(kě)用(yòng)于檢測細胞活力的代謝(xiè)性檢測方法。其檢測原理(lǐ)為(wèi)活細胞線(xiàn)粒體(tǐ)中(zhōng)的琥珀酸脫氫酶(SDH)能(néng)使外源性MTT還原為(wèi)水不溶性的藍紫色結晶甲瓒(Formazan)并沉積在細胞中(zhōng),而死細胞無此功能(néng)。二甲基亞砜(DMSO)能(néng)溶解細胞中(zhōng)的甲瓒,用(yòng)酶标儀在570nm波長(cháng)處測定其光吸收光值,可(kě)間接反映活細胞數量。
MTT法是較早且較為(wèi)經典的方法。但由于MTT法形成的甲瓒是非水溶性的,需要加有(yǒu)機溶劑溶解,這不僅增加了研究人員的工(gōng)作(zuò)量,也給實驗帶來了一定的誤差。一種升級的檢測方法出現了Cell Counting Kit-8,簡稱CCK-8。
CCK-8細胞活性檢測試劑中(zhōng)含有(yǒu)WST-8,一種類似于MTT的化合物(wù),在電(diàn)子耦合試劑存在的情況下,可(kě)以為(wèi)線(xiàn)粒體(tǐ)内的脫氫酶驗明正身。在脫氫酶作(zuò)用(yòng)下,WST-8被還原生成橙黃色的甲瓒産(chǎn)物(wù),用(yòng)酶标儀在OD 450nm波長(cháng)處測定其光吸收值。細胞增殖越多(duō)越快,則顔色越深;細胞毒性越大,則顔色越淺。對于同樣的細胞,顔色的深淺和細胞數目呈線(xiàn)性關系。
CCK-8操作(zuò)比MTT要簡單,生成的有(yǒu)色物(wù)質(zhì)是橙黃色、可(kě)溶于水,在顯色後可(kě)直接比色。加入CCK-8後的細胞液仍可(kě)以繼續培養細胞,對細胞毒性相對較小(xiǎo)。CCK-8法雖說是MTT法的完美升級版,但是CCK-8試劑的顔色為(wèi)淡紅色,與含酚紅的培養基顔色接近,在檢測時容易漏加或多(duō)加。