熒光素酶 (luciferase) 報告基因系統是一種以熒光素 (luciferin) 為(wèi)底物(wù)來檢測熒光素酶活性的報告系統。相比于熒光蛋白，該系統具(jù)有(yǒu)靈敏度高，讀數結果穩定等優點。近幾年，随着生物(wù)醫(yī)藥的蓬勃發展，越來越多(duō)的藥物(wù)選擇熒光素酶報告基因系統作(zuò)為(wèi)生物(wù)學(xué)活性檢測系統。Avelumab（Bavencio）是一個人IgG1抗PD-L1的人源化單克隆抗體(tǐ)，可(kě)解除PD-1/PD-L1介導的免疫抑制，促進T細胞攻擊腫瘤細胞。Avelumab于2017年3月24日獲FDA批準上市，用(yòng)于成人和12歲以上兒童的轉移性默克爾細胞瘤（皮膚癌的一種）的治療。本文(wén)闡述了一種利用(yòng)CD16A-NFAT-Luc報告基因系統評價Avelumab ADCC效應的方法，該法相較于傳統PBMC/NK原代細胞的ADCC檢測方法，具(jù)有(yǒu)操作(zuò)更簡單，材料更易獲得且方法的靈敏度和精(jīng)密度更高的優勢。
1、靶細胞的處理(lǐ)
消化并離心收集PD-L1/CHO， PBS洗滌兩遍後用(yòng)assay medium（RPMI1640）重懸，并将細胞密度調整為(wèi)1×106 cells/mL，備用(yòng)。
2、供試品處理(lǐ)
用(yòng)assay medium将供試品稀釋至30 nM，然後再4倍梯度稀釋至第8個濃度點，備用(yòng)。
3、效應細胞處理(lǐ)
離心收集CD16A-NFAT-Luc效應細胞，PBS洗滌兩遍後再用(yòng)assay medium重懸，并将細胞密度調整為(wèi)5×106cells/mL，備用(yòng)。
4、孵育
在96孔白色平底闆中(zhōng)，分(fēn)别加入30 μL靶細胞，30 μL上述梯度稀釋的供試品，于37℃預孵育30分(fēn)鍾。再加入30 μL效應細胞，混合後放入CO2培養箱中(zhōng)培養5~6 h。
5、檢測
預先取出配制好的Bio-Glory螢火蟲熒光素酶檢測試劑使其恢複至室溫，每孔加入90 μL Bio-Glory試劑，靜置5min後，用(yòng)酶标儀收集化學(xué)發光信号。
RHINOBIO
酶标儀檢測化學(xué)發光信号值（RLU），以濃度為(wèi)橫坐(zuò)标，RLU值為(wèi)縱坐(zuò)标，利用(yòng)SoftMax軟件進行四參數拟合，試驗結果詳見圖1。結果表明Avelumab型可(kě)誘導明顯的ADCC效應，且有(yǒu)良好的量效關系。同時表明該體(tǐ)系可(kě)用(yòng)于抗體(tǐ)類分(fēn)子ADCC效應的檢測。
1、針對不同的靶細胞和效應細胞，需要摸索合适的效靶比以獲得較高的信噪比。
2、效應細胞和靶細胞在做實驗前均需要用(yòng)PBS洗滌，以去除FBS對檢測的影響。
3、報告基因的表達會随着時間呈現先上升後下降的趨勢，需要控制孵育時間，并不是時間越長(cháng)越好。
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