IdeS的介紹

免疫球蛋白 G 降解酶 (Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)，來自釀膿鏈球菌，是一種常見的來自 A 型鏈球菌的半胱氨酸蛋白酶，具(jù)有(yǒu)水解 IgG 的肽鏈内肽酶活性，它可(kě)以識别抗體(tǐ)的鉸鏈區(qū)即CH1 結構域和CH2 結構域之間并特異性降解 IgG^[1]。

IdeS結構特征

IdeS的底物(wù)特異性

到目前為(wèi)止，IgG 是 IdeS 作(zuò)用(yòng)的唯一底物(wù)，研究發現 IdeS 還不能(néng)作(zuò)用(yòng)于已知的可(kě)被其他(tā)半胱氨酸蛋白酶水解的合成産(chǎn)物(wù)。“Y”型的 IgG 分(fēn)子是由兩條相似的重鏈和兩條相似的輕鏈構成，是一種大分(fēn)子四聚體(tǐ) (約 150KD)，每一個輕鏈通過一個二硫鍵與重鏈連接，而兩個重鏈是在鉸鏈區(qū)通過至少兩個二硫鍵連接。IdeS作(zuò)用(yòng)的斷裂位點位于 IgG 重鏈上 CH2 結構域前面即鉸鏈區(qū)的 Gly-236 和Gly-237 之間，用(yòng) IdeS 酶切 IgG 的重鏈之後可(kě)以獲得 F(ab)2片段和完整的兩個單體(tǐ) Fc 片段，與抗原結合的抗體(tǐ)重鏈 F(ab)2片段分(fēn)子量大小(xiǎo)約為(wèi) 100KD，恒定區(qū) Fc 片段的分(fēn)子量大小(xiǎo)為(wèi) 25KD。

IgG與IdeS相互作(zuò)用(yòng)機理(lǐ)

免疫球蛋白在人體(tǐ)免疫防禦系統中(zhōng)起到至關重要的作(zuò)用(yòng)，通過特異性識别并介導專職吞噬細胞或補體(tǐ)系統或者二者同時作(zuò)用(yòng)來清除外來微生物(wù)。免疫球蛋白 Ig由識别抗原的 Fab 片段，以及通過靈活的鉸鏈區(qū)連接的恒定區(qū) Fc 片段組成，其中(zhōng) Fc 效應區(qū)域通過結合 C1q 觸發經典的補體(tǐ)激活途徑。另外，IgG 抗體(tǐ)還可(kě)以通過結合細菌表面的結構，并且暴露出抗體(tǐ)的 Fc 區(qū)域介導與吞噬細胞攜帶的FcγR受體(tǐ)相互作(zuò)用(yòng)。補體(tǐ)的經典途徑最初是通過補體(tǐ)因子 C1q 與 IgG 或者 IgM特異性相互作(zuò)用(yòng)開始，結合後引起一系列的蛋白級聯反應的激活，随後導緻補體(tǐ)因子 C3b 對免疫複合體(tǐ)表面的粘附。C3b 可(kě)以被吞噬細胞表面的補體(tǐ)受體(tǐ)識别，然後介導這些複合體(tǐ)的吞噬作(zuò)用(yòng)。除了具(jù)有(yǒu)保護性作(zuò)用(yòng)之外，IgG 也和疾病相關。在約 5%的人體(tǐ)内，其對自身免疫疾病的影響已得以證實，在如下疾病中(zhōng)：類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡，重症肌無力症，免疫性 (或自發性) 血小(xiǎo)闆減少症等。

為(wèi)了避開特異性抗體(tǐ) IgG 的不利因素，釀膿鏈球菌自身也發展出幾種不同的策略來對抗 IgG 功能(néng)的幹涉。釀膿鏈球菌自身會表達一種細胞壁錨定表面蛋白，這種能(néng)夠介導蛋白-蛋白之間相互作(zuò)用(yòng)的成員稱之為(wèi)M-蛋白家族，當IgG的Fc片段與M蛋白結合後，Fc結合區(qū)域被阻，也就不能(néng)與補體(tǐ)因子C1q結合，，從而使之Fc介導的吞噬作(zuò)用(yòng)受損。另外釀膿鏈球菌會分(fēn)泌一種内切糖苷酶 EndoS，能(néng)夠水解 IgG 上保守的 N-連接寡糖，水解之後的 IgG 降低了結合 Fc 受體(tǐ)的能(néng)力，從而使Fc介導的吞噬作(zuò)用(yòng)受損。

IdeS酶學(xué)性質(zhì)的研究

蛋白酶IdeS發揮高活性的pH範圍是 5.1~8.0，最适pH是 6.6，當pH大于 10 時，該酶仍保持一定的活性，但在酸性條件下不穩定。最适反應溫度在 37℃左右，在大于熱力學(xué)溫度 42℃時有(yǒu)一定程度的降解。在 37℃，pH6.6，50mM 磷酸鹽緩沖液中(zhōng)反應 30min 可(kě)完全切開 1μg 的 IgG 抗體(tǐ) (≥95%) 所需的酶量定義為(wèi)一個活性單位。

其他(tā)半胱氨酸蛋白酶相似，蛋白酶IdeS活性受蛋白酶抑制劑吲哚乙酸和碘乙酰胺的抑制，但是不同之處是，蛋白酶IdeS酶活性卻不受蛋白酶抑制劑 E64、血清胱抑素的影響，以及絲氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白酶抑制劑等對IdeS酶活性也沒有(yǒu)影響。

IdeS酶的應用(yòng)

1、用(yòng)于多(duō)克隆 IgG-Fc N-糖基化和異構體(tǐ)分(fēn)析

多(duō)克隆人免疫球蛋白 G (IgG) 糖基化的方法通常包括蛋白質(zhì)消化或聚糖釋放。雖然這些方法可(kě)以深入表征，但它們也會導緻丢失有(yǒu)關某些亞類、同種異型和共同發生的翻譯後修飾 (PTM) 的信息。多(duō)克隆 IgG 的高度可(kě)變性使得它們的完整質(zhì)譜 (MS) 分(fēn)析極具(jù)挑戰性，可(kě)以使用(yòng)IgG 的 Fc區(qū)域，獲得N-糖基化和亞類和同種異型的其他(tā) PTM 的綜合信息。人血漿 IgG 使用(yòng) Fc 特異性分(fēn)離，然後将CH2結構域用(yòng)酶IdeS消化。獲得的 Fc 亞基混合物(wù)通過毛細管電(diàn)泳 (CE) 和親水相互作(zuò)用(yòng)液相色譜 (HILIC) 與 MS 聯用(yòng)進行分(fēn)析。CE-MS 提供了不同 IgG 亞類和同種異型的分(fēn)離，而 HILIC-MS 允許分(fēn)離不同的糖型及其氧化變體(tǐ)^[4]。

2、用(yòng)于ADC藥物(wù)平均偶聯率的測定

可(kě)以将ADC藥物(wù)采用(yòng)IdeS酶切，從鉸鏈區(qū)下方将抗體(tǐ)切開，然後還原，得到Fc/2、輕鏈L0，偶聯一個小(xiǎo)分(fēn)子藥物(wù)的輕鏈L1、Fd、偶聯1-3個小(xiǎo)分(fēn)子藥物(wù)的Fd1-Fd3，最後采用(yòng)反相高效液相色譜(PR-MS)、親水相互作(zuò)用(yòng)色譜與質(zhì)譜聯用(yòng) (HILIC-MS)進行分(fēn)析^[5]。

3、在抗 AAV 中(zhōng)和抗體(tǐ)存在的情況下實現體(tǐ)内基因治療

基因治療可(kě)通過AAV載體(tǐ)的全身給藥治療多(duō)種人類疾病的。然而，針對 AAV 衣殼的預處理(lǐ)中(zhōng)和抗體(tǐ)對 AAV 基因轉移構成了主要限制，因為(wèi)它們即使在相對較低的滴度也會阻止靶組織轉導。

IdeS可(kě)以有(yǒu)效地裂解抗AAV抗體(tǐ)，從而增強 IgG 清除率，并将其在血液中(zhōng)的 AAV 中(zhōng)和活性降低到與肝細胞轉導相容的水平。在 AAV 載體(tǐ)輸注時用(yòng)IdeS進行預處理(lǐ)是一種潛在的策略，可(kě)以在存在低至中(zhōng)度預先存在的抗衣殼抗體(tǐ)的情況下實現有(yǒu)效的全身基因轉移，這在人類中(zhōng)很(hěn)常見，并且可(kě)能(néng)允許重複載體(tǐ)給藥^[6]。