治療性單克隆抗體(tǐ)屬于IgG類，含有(yǒu)N-連接寡糖。典型的IgG類抗體(tǐ)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們形成三個不同的結構域，包括兩個相同的Fab（抗原結合）結構域和一個Fc結構域。Fc 結構域是重鏈的同源二聚體(tǐ)，在Asn-297位置帶有(yǒu)N-糖基化保守位點。Fc結構域與免疫細胞表面的Fc受體(tǐ)(FcγR)結合來參與免疫細胞的募集，并直接啓動免疫反應，包括吞噬作(zuò)用(yòng)、免疫細胞激活和細胞因子對抗原展示靶點的刺激。Fc結構域的糖基化介導與FcγR的相互作(zuò)用(yòng)并調節抗體(tǐ)依賴性效應器功能(néng)，包括抗體(tǐ)依賴性細胞毒性 (ADCC)，其包含激活自然殺傷細胞以啓動癌細胞的裂解，和補體(tǐ)-依賴性細胞毒性（CDC），它涉及靶細胞裂解的啓動和補體(tǐ)途徑的部署。
研究表明，IgG的Asn297的聚糖含有(yǒu)的核心岩藻糖或末端唾液酸會降低IgG對Fcγ受體(tǐ)的親和力。無論是敲除編碼α1,6-岩藻糖基轉移酶 (Fut8) 的基因還是過表達編碼GnT-III轉移酶 (Mgat3) 的基因都會導緻Asn297缺乏核心岩藻糖基化，可(kě)以提高把IgG對FcγRIIIa 的親和力，從而增強ADCC效應。因此單克隆抗體(tǐ)的糖基化修飾分(fēn)析至關重要。
從廣義上講，治療性蛋白質(zhì)的糖基化分(fēn)析可(kě)以在三個水平上進行，即完整蛋白質(zhì)、糖肽和釋放的聚糖。
圖片來源Challenges of glycosylation analysis andcontrol: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs
有(yǒu)多(duō)種分(fēn)析方法可(kě)在完整蛋白質(zhì)水平上進行表征，包括色譜、電(diàn)泳、MS和其他(tā)光譜技(jì )術。由于卓越的分(fēn)辨率，MS已成為(wèi)在開發過程的許多(duō)階段表征 mAb的關鍵分(fēn)析工(gōng)具(jù)，質(zhì)譜分(fēn)析常用(yòng)的離子化技(jì )術為(wèi)MALDI和ESI,二者均為(wèi)軟電(diàn)離技(jì )術，具(jù)有(yǒu)很(hěn)強的互補性，并兼具(jù)高通量、高分(fēn)辨率、高靈敏度等特點，但由于離子化可(kě)能(néng)引起唾液酸殘基等不穩定糖苷鍵的斷裂，分(fēn)析前需要對糖鏈進行(全)甲基化衍生或對唾液酸殘基進行衍生保護。其中(zhōng)，MALDI是一種快速、簡單的糖鏈離子化方法，對鹽等幹擾物(wù)的耐受力強，因電(diàn)離産(chǎn)生的離子多(duō)為(wèi)單電(diàn)荷而便于解析。另外可(kě)以通過高分(fēn)辨率質(zhì)量分(fēn)析儀，包括ToF、Orbitrap和傅裏葉變換離子回旋共振(FT-ICR)儀器來解決小(xiǎo)的質(zhì)量差異。
在質(zhì)譜分(fēn)析過程中(zhōng)，糖肽因結構複雜、分(fēn)子質(zhì)量大、離子化效率低、殘留多(duō)肽幹擾而較糖鏈分(fēn)析更加困難。目前報道的糖肽分(fēn)析方法主要有(yǒu)一級質(zhì)譜（MS1）和串聯質(zhì)譜（MS2）。一級質(zhì)譜水平的糖肽分(fēn)析：糖肽在MS1水平的直接鑒定依賴于高分(fēn)辨質(zhì)譜儀采集糖肽精(jīng)确分(fēn)子質(zhì)量的同位素分(fēn)布數據。在多(duō)肽中(zhōng)，其主要組成元素為(wèi)C、H、N 等(同位素間均隻有(yǒu)1 u差異)。然而，糖肽中(zhōng)含有(yǒu)較多(duō)的氧元素，自然界中(zhōng)16O與18O之間存在2 u差異。因此，其特征性的同位素峰型在理(lǐ)論上可(kě)以用(yòng)于糖肽的識别和鑒定，但對質(zhì)譜儀的性能(néng)要求較高。MS2水平的糖肽分(fēn)析：糖肽的鑒定一般通過串聯質(zhì)譜結合數據庫搜索進行确定。常見的串聯質(zhì)譜碎裂方式有(yǒu)碰撞誘導解離（CID）、高能(néng)碰撞解離（HCD）、電(diàn)子轉移解離（ETD）。CID碎裂技(jì )術能(néng)量較高，糖肽裂解作(zuò)用(yòng)于肽鏈上的聚糖，産(chǎn)生一系列與聚糖裂解有(yǒu)關的碎片離子。然而，因糖肽的分(fēn)子質(zhì)量較大，CID-MS2圖譜無法檢測到氧鎓離子信号，不利于糖肽MS2譜圖的解析。
聚糖的釋放可(kě)采用(yòng)生物(wù)酶解和化學(xué)水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)、N-糖苷酶A(PNGase A)、糖苷内切酶H(Endo H)和糖苷内切酶S(Endo S) 是常用(yòng)的從蛋白質(zhì)氨基酸鏈上酶解聚糖的糖苷酶。PNGase F可(kě)用(yòng)于糖肽或完整蛋白上連接的聚糖釋放，然後可(kě)以利用(yòng)一系列酶包括：尿素節杆菌唾液酸酶 (ABS)、牛睾丸β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-岩藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）聯合作(zuò)用(yòng)，根據外切糖苷酶的特異性，可(kě)以将共洗脫的聚糖分(fēn)開。
為(wèi)提高檢測的靈敏度，基于HPLC的聚糖分(fēn)析工(gōng)作(zuò)流程通常包括聚糖的熒光标記。一些熒光标簽已連接到N-聚糖上，例如 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 和 2-氨基苯甲酸 (2-AA)。使用(yòng)HILIC作(zuò)為(wèi)分(fēn)離模式和使用(yòng)熒光标記的葡聚糖作(zuò)為(wèi)标準物(wù)質(zhì)，不同的操作(zuò)人員可(kě)以在不同的系統上進行快速且高度可(kě)重複的完成糖鏈分(fēn)析。糖鏈的分(fēn)析可(kě)從RP-HPLC和CE-LIF平台收集的數據，專用(yòng)實驗數據庫（即Glycobase），以及通過HILIC-HPLC/UPLC分(fēn)析的大量聚糖種類的歸一化保留時間值（GU值），再加上外切糖苷酶陣列消化如下圖，可(kě)以使結構分(fēn)配相對簡單。
使用(yòng)N-聚糖的外切糖苷酶陣列消化确定單糖組成和連接，本實驗中(zhōng)使用(yòng)的一系列酶包括：尿素節杆菌唾液酸酶 (ABS)、牛睾丸 β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-岩藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）。根據外切糖苷酶的特異性，可(kě)以将共洗脫的聚糖分(fēn)開。
蛋白質(zhì)的糖基化是一種重要的翻譯後修飾，糖基化蛋白中(zhōng)的寡糖為(wèi)非模闆合成，并呈複雜的樹枝狀結構，據報道僅由6種單糖組成的寡糖鏈，其理(lǐ)論結構即達到驚人的1012種。宿主細胞、生産(chǎn)工(gōng)藝等各種影響因素更增加了糖基化修飾結構的複雜性。因此選擇合适的方法及工(gōng)具(jù)酶對蛋白質(zhì)的糖基化修飾進行表征尤為(wèi)關鍵。
參考文(wén)獻
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