内毒素
内毒素(即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多(duō)糖分(fēn)子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透徹也是最常見的生物(wù)熱原，注射即使是 pg 級别的痕量 LPS 也會導緻病人嚴重的熱原反應，引起人體(tǐ)發熱、休克甚至死亡。内毒素普遍存在且不易滅活，對制藥和醫(yī)療器械行業是一個挑戰。因此生物(wù)制品類、注射用(yòng)藥劑、化學(xué)藥品類、放射性藥物(wù)、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類(如一次性注射器，植入性生物(wù)材料)都需檢測内毒素含量，符合标準的才允許投入市場銷售。同時，靈敏可(kě)靠的内毒素檢測技(jì )術也是必須的。随着時代的發展，内毒素檢測方法也在不斷更新(xīn)。
上圖5種方法中(zhōng)，凝膠法可(kě)做定性判斷，其他(tā) 4 種方法能(néng)夠進行定量檢測，通過标準曲線(xiàn)的繪制，計算出待測樣品的内毒素含量。本文(wén)介紹的重組 C 因子法，通過内毒素結合并激活的重組 C 因子能(néng)夠切割底物(wù)獲得遊離的熒光基團，熒光基團的釋放與内毒素的濃度呈正比，從而使得内毒素被定量檢測。與其他(tā) 3 種定量檢測方法相比，具(jù)有(yǒu)更好的特異性，不受旁路 G 因子的幹擾，見下圖示意。
2021 年 2 月 5 日，國(guó)家林業和草(cǎo)原局、農業農村部發布公(gōng)告(2021 年第 3 号)，調整後的«國(guó)家重點保護野生動物(wù)名(míng)錄»正式發布，将我國(guó)分(fēn)布的鲎科(kē)動物(wù)(中(zhōng)國(guó)鲎、圓尾蠍鲎)升級為(wèi)國(guó)家二級保護動物(wù)。随後，3 月 22 日，湛江安(ān)度斯發布公(gōng)告稱，由于受國(guó)家政策影響，内毒素檢測試劑原料将受到嚴格管控，并表示迫于形勢，決定停止供應以下産(chǎn)品：
● 單支凝膠法鲎試劑(0.1mL)- 靈敏度 0.5、0.25、0.125、0.06 EU/mL 将于今年 6 月 30 日停産(chǎn)
● 四次裝(zhuāng)凝膠法鲎試劑(0.5mL)- 靈敏度 0.25、0.125EU/mL 将于今年 12 月 31 日停産(chǎn)
文(wén)中(zhōng)表示，國(guó)内藥品、醫(yī)療器械放行将面臨困境，并建議藥企、醫(yī)療器械企業盡早選擇其他(tā)替代測試方法。對于經常使用(yòng)内毒素檢測試劑的小(xiǎo)夥伴來說，這無疑是一則重磅消息，畢竟在内毒素檢測方面，鲎試劑是中(zhōng)國(guó)藥典通則規定使用(yòng)的試劑之一，也是其中(zhōng)被應用(yòng)地最為(wèi)廣泛的一種。
不過，我們可(kě)以同樣在藥典中(zhōng)找到解決之法——重組 C 因子法，該方法目前已被多(duō)家全球監管機構所接受，是未來内毒素檢測方法的發展方向：
2018 年 9 月 27 日
FDA 已批準 rFC 用(yòng)于 Eli Lilly 的偏頭痛藥品 Galcanezumab 的最終産(chǎn)品的細菌内毒素檢測及産(chǎn)品放行。
2020 年 6 月
2020 版中(zhōng)國(guó)藥典《9251 細菌内毒素檢查法應用(yòng)指導原則》提出，可(kě)使用(yòng)重組 C 因子法進行内毒素檢查。
2020 年 9 月
USP 新(xīn)增通則<1085.1>，将重組試劑進行細菌内毒素的檢測方法正式收錄于《美國(guó)藥典-國(guó)家處方集》(USP-NF)中(zhōng)。
2021 年 1 月 1 日
歐洲藥典EP 2.6.32 正式實施。
Rhinogen® 重組 C 因子内毒素檢測試劑盒
Rhinogen®重組 C 因子内毒素檢測試劑盒是一種不依賴于動物(wù)源性成分(fēn)，靈敏度高、特異性高、可(kě)穩定且持續提供的替代鲎試劑的内毒素測定試劑，使用(yòng)此試劑進行内毒素檢測具(jù)有(yǒu)相當的優越性：
● 終點熒光測定，與其他(tā)定量 LAL 方法相當，同時提高準确性
rFC 法相比鲎試劑動态顯色法具(jù)有(yǒu)更高的檢測準确性
● 靈敏度範圍從 0.005 到 5EU/ml，準确性也有(yǒu)所提高
rFC 内毒素檢測試劑盒的檢測靈敏度高，檢測範圍為(wèi) 0.005EU/ml-5EU/ml
● 使用(yòng)液體(tǐ)試劑，方便簡單，并且由重組表達生産(chǎn)，産(chǎn)品批間一緻性良好
不同批次的 rFC 内毒素檢測試劑盒檢測的标準曲線(xiàn)。表明産(chǎn)品具(jù)有(yǒu)良好的的批間一緻性
● 内毒素特異性檢測，無 G 因子旁路幹擾 [1]
葡聚糖存在時，LAL 顯色法會受到 G因子旁路的幹擾，而 rFC 法不受幹擾
● 不依賴動物(wù)源性成分(fēn)，符合3R的替代原則，同時提供更高的供應安(ān)全性
Rhinogen®重組 C 因子内毒素檢測試劑盒可(kě)替代傳統鲎試劑用(yòng)于人用(yòng)和動物(wù)用(yòng)注射藥物(wù)（如化學(xué)藥品、放射性藥物(wù)、抗生素類、生物(wù)制品等）及醫(yī)療器械(如透析液、植入式器械等)的原輔材料、中(zhōng)間産(chǎn)品、放行産(chǎn)品的内毒素檢測。
試劑盒采用(yòng)終點熒光檢測，Molecular Devices 多(duō)款熒光/多(duō)功能(néng)酶标儀都能(néng)夠滿足檢測需要，包括：SpectraMax Gemini 系列、SpectraMax M 系列、SpectraMax i 系列、SpectraMax Paradigm。
根據 Rhinogen® 重組 C 因子内毒素檢測試劑盒的要求，我們設置了統一的檢測模闆(如需模闆請關注RhinoBio公(gōng)衆号咨詢在線(xiàn)客服)。酶标儀溫度設置 37℃，分(fēn)别在 0h 和 1h 進行相對熒光強度檢測，讀值記作(zuò) T0 和 T1。所有(yǒu)孔的 ΔRFU=T1-T0，标準品/樣品淨 ΔRFU= 标準品/樣品 ΔRFU- 陰性對照 ΔRFU。以内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液濃度為(wèi)橫坐(zuò)标，淨 ΔRFU 為(wèi)縱坐(zuò)标繪圖并進行 Log-Log 拟合，log(ΔRFU) = A*log(内毒素濃度 EU/ml)+B。
本次推送的第二篇文(wén)章中(zhōng)詳細列舉了使用(yòng) 4 種不同型号的 Molecular Devices 酶标儀進行重組 C 因子法内毒素檢測的方法及結果。數據結果表明，不同型号的酶标儀均能(néng)夠進行重組 C 因子檢測，标準曲線(xiàn)展現了優秀的線(xiàn)性，SpectraMax i3x R2 值達到了 1.000。多(duō)款儀器樣品 2 複孔 CV 值小(xiǎo)于 5%，展現了優異的複孔重現性;加标回收率在 82%~113% 之間，明顯優于中(zhōng)國(guó)藥典 2020 版要求 50%~200% 的範圍。
同時，Molecular Devices 提供完整的合規解決方案，包括一整套符合 GLP/GMP 要求的儀器硬件确認和企業版軟件，能(néng)夠滿足内毒素檢測涉及到藥物(wù)和醫(yī)療器械的原輔材料、中(zhōng)間産(chǎn)品、放行産(chǎn)品的檢測，數據采集和分(fēn)析軟件及儀器硬件都必須符合相應法規的要求。
企業版軟件：
SoftMax® Pro 7.1.2 GxP 是 Molecular Devices 最新(xīn)、最安(ān)全的一款企業版軟件，符合全新(xīn)的 FDA 21 CFR Part 11 的工(gōng)作(zuò)流程，以确保您獲得數據的完整性。每個步驟都經過優化，其目的是簡化分(fēn)析流程和報告生成時間，以便于支持我們的酶标儀更快獲得完整、可(kě)靠的數據。
為(wèi)了确保您的酶标儀符合要求，可(kě)通過使用(yòng)完整的、系統的 IQOQ 服務(wù)，Molecular Devices 專業的技(jì )術團隊會通過耐心、認真的服務(wù)迅速協助您建立單機或網絡版的合規軟件系統，SoftMax Pro 7.1.2 GxP 軟件主要在數據隐私和安(ān)全性上做了重大改進，使其充分(fēn)符合新(xīn)版本 GDPR 規定。
[1]除了不受葡聚糖引起的 G 因子旁路幹擾，重組 C 因子内毒素檢測與經典的鲎試劑内毒素檢測方法一樣都會受到檢測基質(zhì)中(zhōng)高鹽、強酸強堿、血漿、天然熒光物(wù)質(zhì)等成分(fēn)的幹擾。由于檢測的幹擾始終是産(chǎn)品特異性的，因此每種産(chǎn)品均應進行正常的幹擾驗證研究。