介 紹
在制藥和醫(yī)療器械生産(chǎn)過程中(zhōng)，對污染物(wù)樣品的監測是一個關鍵步驟。内毒素存在于革蘭氏陰性細菌的細胞壁中(zhōng)，是一種常見的污染物(wù)，可(kě)引起發燒、炎症、頭痛、惡心，甚至死亡。
内毒素的常規檢測方法是鲎試劑溶酶法（LAL），核心成分(fēn)由鲎的血液中(zhōng)提取而來。在内毒素存在的情況下，LAL 通過酶促級聯凝固，可(kě)以通過比濁法或顯色法定量（圖 1 A）。這些方法涉及多(duō)個酶的步驟，并受限于鲎資源的多(duō)少。
2021 年 2 月 5 日，國(guó)家林業和草(cǎo)原局、農業農村部發布公(gōng)告，調整後的«國(guó)家重點保護野生動物(wù)名(míng)錄»正式發布，将我國(guó)分(fēn)布的鲎科(kē)動物(wù)（中(zhōng)國(guó)鲎、圓尾蠍鲎）升級為(wèi)國(guó)家二級保護動物(wù)。
中(zhōng)國(guó)藥典 2020 年版 9251 細菌内毒素檢查法應用(yòng)指導原則中(zhōng)指出，目前新(xīn)的細菌内毒素檢測方法不斷出現，以适應特殊品種細菌内毒素檢查的需要，或減少鲎試劑的使用(yòng)量。如重組 C 因子法（見附）、微量凝膠法等。
附：重組C 因子法
C 因子是鲎試劑中(zhōng)對細菌内毒素敏感的蛋白，能(néng)夠選擇性識别内毒素。重組 C 因子是一種人工(gōng)合成的 C 因子，它被細菌内毒素活化後，可(kě)與熒光底物(wù)作(zuò)用(yòng)産(chǎn)生與内毒素濃度成比例的熒光信号。
本法系依據反應混合物(wù)中(zhōng)的内毒素濃度和其孵育終止時的熒光值之間存在量化關系來測定細菌内毒素的含量。本法為(wèi)終點熒光法。依據檢測原理(lǐ)，本法不存在 G 因子旁路幹擾，具(jù)有(yǒu)較高的專屬性，因此适合于含有(yǒu) β- 葡聚糖幹擾的樣品檢測；本法所用(yòng)試劑不含有(yǒu) B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有(yǒu)對上述物(wù)質(zhì)抑制或增強作(zuò)用(yòng)的樣品适合使用(yòng)重組 C 因子法。
重組 C 因子法試驗需采用(yòng)熒光酶标儀，其激發和發射波長(cháng)等參數參照試劑的使用(yòng)說明書，激發/發射波長(cháng)一般為(wèi) 380nm/440nm，檢測溫度一般為(wèi) 37°C ±1°C 。
圖 1 酶促級聯反應 LAL（A）和重組 C 因子 rFC 分(fēn)析（B）。rFC 分(fēn)析包括一個一步的酶聯反應，消除了對鲎的需要，同時避免葡聚糖引起的 G 因子非特異性幹擾造成的假陽性。
圖 2 當葡聚糖存在時，LAL 顯色法和 rFC 法反應特異性比較。
材料
方 法
① 取用(yòng) 4 支一次性無熱原安(ān)瓿瓶，在瓶身标明内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液濃度（分(fēn)别 0.005、0.05、0.5及5EU/ml），用(yòng)溶解至 20EU/ml 的内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液制備系列内毒素标準品溶液。
② 提前将微孔闆讀闆機的溫度設置為(wèi)37℃待用(yòng)。将 100μl 陰性對照（無熱原水）、内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液、樣品（兩組）分(fēn)别加入到 96 孔無菌無熱原白闆相應孔中(zhōng)，兩複孔。兩組樣品中(zhōng)分(fēn)别加入 10μl 0.5EU/ml 的内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液作(zuò)為(wèi)加标樣品組。加樣後的 96 孔闆在 37°C ± 1°C 的微孔闆讀闆機中(zhōng)，預熱 10-20 分(fēn)鍾。
③ 微孔闆預熱時，配置底物(wù)試劑。按照 5:4:1 的比例混合熒光底物(wù)溶液、測定緩沖液和 rFC 酶溶液，輕輕地充分(fēn)混合，切勿漩渦混合。
④ 設置讀闆參數：
激發/發射波長(cháng)設置為(wèi) 380/440nm，PMT Gain 設置成 Automatic，頂讀。以 i3x 為(wèi)例，酶标儀讀闆設置如下圖所示。
取出預熱的 96 孔闆，向所有(yǒu)樣品孔中(zhōng)加入 100μl/ 孔底物(wù)試劑。
讀取 0h 的相對應熒光強度 T0，将微孔闆繼續 37°C ± 1°C 孵育 1h，讀取 1h 的相對熒光強度 T1。
⑤ 數據分(fēn)析：
以内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液濃度為(wèi)橫坐(zuò)标，淨 ΔRFU 為(wèi)縱坐(zuò)标繪圖并進行 Log-Log 拟合，log(ΔRFU) = A*log(内毒素濃度 EU/ml)+B
說明：
所有(yǒu)孔的 ΔRFU=T1-T0
标準品/樣品的淨 ΔRFU= 标準品/樣品的ΔRFU-陰性對照 ΔRFU
結 果
Molecular Devices 的 4 款微孔闆讀闆機，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均符合重組 C 因子試劑盒檢測要求。我們已根據Rhinogen® 重組 C 因子内毒素檢測試劑盒的說明書編輯了統一的模闆，直接調用(yòng)模闆即可(kě)讀數。
标準曲線(xiàn)以内毒素工(gōng)作(zuò)标準品溶液濃度為(wèi)橫坐(zuò)标，淨 ΔRFU 為(wèi)縱坐(zuò)标繪圖并進行 Log-Log 拟合。标準品有(yǒu) 5 個梯度（0，0.005 EU/ml，0.05 EU/ml，0.5 EU/ml，5EU/ml），每個樣品 2 複孔。所有(yǒu) 4 款型号儀器的 R2 值都在 0.998以上，加标回收率也都在中(zhōng)國(guó)藥典 2020 版要求以内。具(jù)體(tǐ)數據如下，
圖 3 SpectraMax M2e， 标準曲線(xiàn) R2 值 0.999
圖 4 SpectraMax M5e ，标準曲線(xiàn) R2 值 0.999，兩個樣品加标回收率分(fēn)别為(wèi) 110% 和 120%
圖 5 SpectraMax iD3，标準曲線(xiàn) R2 值 0.998，兩個樣品加标回收率分(fēn)别為(wèi) 82% 和 98%
圖 6 SpectraMax i3x，标準曲線(xiàn) R2 值 1.000，兩個樣品加标回收率分(fēn)别為(wèi) 102% 和 113%
結 論
Molecular Devices的4款多(duō)功能(néng)微孔闆讀闆機，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3和SpectraMax i3x均能(néng)夠進行重組C因子檢測，标準曲線(xiàn)展現了完美的線(xiàn)性，SpectraMax i3x R2值達到了1.000。3款儀器樣品2複孔CV值小(xiǎo)于5%，展現了優異的複孔重現性；加标回收率在82%~113%之間，明顯優于中(zhōng)國(guó)藥典2020版要求50%~200%的範圍。
SoftMax Pro 軟件可(kě)用(yòng)于分(fēn)析數據，繪制标準曲線(xiàn)後，自動計算生成 R2和CV值，調用(yòng)預先設置好的模闆可(kě)以自動計算出樣品的加标回收率并作(zuò)結果判讀。