上海瑞諾生物(wù)科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司

瑞諾知識分(fēn)享 || 蛋白翻譯後修飾研究：Middle-down分(fēn)析方式

發布時間： 9/22/2022 3:21:02 PM

RHINOBIO

背景介紹

Bottom-up的分(fēn)析策略是一種将蛋白質(zhì)/酶的大片段混合物(wù)分(fēn)解成小(xiǎo)片段的肽段以進行分(fēn)析的策略，被廣泛應用(yòng)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

Middle-down的分(fēn)析策略使用(yòng)不同的酶來獲得較長(cháng)的肽，采用(yòng)此方法可(kě)以分(fēn)析較長(cháng)的肽鏈上同時發生的幾種翻譯後修飾。

Top-down分(fēn)析策略不需要進行酶解過程，直接分(fēn)析完整的蛋白質(zhì)，這種方法可(kě)以獲得完整的生物(wù)學(xué)信息。

下面将簡單介紹Middle-down方法在蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)組學(xué)分(fēn)析及抗體(tǐ)藥物(wù)分(fēn)析方面的應用(yòng)。

Middle-down是一種新(xīn)興的方法，可(kě)用(yòng)于研究蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組學(xué)。Middle-down方法涉及蛋白水解或化學(xué)降解步驟（這是Bottom-up方法的特征）獲得的短肽（而不是“完整蛋白質(zhì)”），但所得肽段的大小(xiǎo)比Bottom-up方法中(zhōng)得到的肽段大。利用(yòng)Bottom-up方法通常得到長(cháng)度約為(wèi)7-20個氨基酸殘基（M：0.8-2kDa），Middle-down将生成長(cháng)度為(wèi)約20-100個氨基酸的肽段，分(fēn)子量（M）：2.5kDa

Middle-down的檢測流程，簡述如下：

1、蛋白質(zhì)水解

通過優化蛋白水解的孵育時間或通過适當控制酶和底物(wù)的相對濃度，對蛋白質(zhì)的Middle-down研究進行了限制性消化，使用(yòng)廣泛可(kě)用(yòng)且相對便宜的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。為(wèi)了簡化此過程，已有(yǒu)一些特殊的酶如OmpT、Sap9和IdeS用(yòng)于Middle-down的檢測。OmpT是一種屬于omptin家族的新(xīn)型蛋白酶，具(jù)有(yǒu)催化連續二堿基位點 K↓R、R↓R、R↓K和K↓K之間肽鍵切割的特異性；Sap9（白色念珠菌) 是一種源自yapsin家族的天冬氨酸蛋白酶；兩種酶都能(néng)夠産(chǎn)生長(cháng)度>2kDa的肽；IdeS是一種半胱氨酸蛋白酶，一種來自Streptococcus pyogenes的免疫球蛋白降解酶，可(kě)特異性切割所有(yǒu)IgG亞類的鉸鏈區(qū)，通過IdeS市售抗體(tǐ)西妥昔單抗、利妥昔單抗等進行IdeS處理(lǐ)，獲得了三種更大尺寸的蛋白水解肽。

2、分(fēn)離

與基因組研究相比，蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對更複雜，因為(wèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)同種型、翻譯後修飾和各種分(fēn)析的表征，以監測細胞/組織生長(cháng)不同階段的表達水平。因此，不同類型的分(fēn)離策略對于蛋白質(zhì)組學(xué)至關重要，以降低蛋白質(zhì)組的複雜性。各種分(fēn)離或色譜方法的應用(yòng)可(kě)以顯着影響 MS 對低豐度水平的蛋白質(zhì)/蛋白水解肽的檢測和分(fēn)析。蛋白質(zhì)組的分(fēn)離包括凝膠電(diàn)泳、毛細管電(diàn)泳、反相色譜。

3、質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜儀基本上具(jù)有(yǒu)三個模塊，即離子源或電(diàn)離源、質(zhì)量分(fēn)析器和檢測器。由于 ESI和MALDI等軟電(diàn)離方法的出現，這兩種電(diàn)離模式可(kě)以成功地應用(yòng)于各個領域，主要是為(wèi)了完整的分(fēn)子量測量。事實上，蛋白質(zhì)組學(xué)領域的快速發展主要是通過應用(yòng)這兩種電(diàn)離模式來推動的。MALDI主要産(chǎn)生完整肽或蛋白質(zhì)分(fēn)子的單質(zhì)子化離子，而蛋白質(zhì)或肽的多(duō)質(zhì)子化離子種類通過ESI檢測/産(chǎn)生。

從大腸杆菌到釀酒酵母，從中(zhōng)國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細胞到轉基因動物(wù)，多(duō)種宿主已被成功用(yòng)于生物(wù)技(jì )術藥物(wù)生産(chǎn)，在用(yòng)于藥物(wù)生産(chǎn)前，一般通過基因工(gōng)程手段改造宿主的遺傳信息以适于高效的藥物(wù)生産(chǎn)，對改造的遺傳信息和藥物(wù)序列分(fēn)析是産(chǎn)品/工(gōng)藝開發和質(zhì)量研究的重要部分(fēn)。将改造的質(zhì)粒轉染表達細胞（例如CHO），加壓篩選出可(kě)穩定表達目的基因的細胞株，經過放大培養、純化獲得目的産(chǎn)物(wù)。

篩選得到的細胞株在傳代過程中(zhōng)可(kě)能(néng)發生遺傳突變，這将導緻細胞群的微觀異質(zhì)性，而且突變株還可(kě)能(néng)獲得選擇優勢而産(chǎn)生克隆替換。在包括疫苗、基因治療和治療性蛋白等生物(wù)技(jì )術藥物(wù)的生産(chǎn)過程中(zhōng)，這些自發性突變對最終産(chǎn)品的質(zhì)量構成風險，因此對最終的蛋白産(chǎn)物(wù)進行氨基酸序列的分(fēn)析至關重要。蛋白藥物(wù)具(jù)有(yǒu)很(hěn)高的異質(zhì)性，這些藥物(wù)利用(yòng)不同的表達系統（例如CHO細胞）産(chǎn)生，同時會伴随多(duō)種修飾，例如糖基化、N端焦谷氨酰胺環化、C端賴氨酸加工(gōng)、脫酰胺、異構化和氧化。

當将蛋白質(zhì)等生物(wù)大分(fēn)子引入質(zhì)譜儀時，它們會被離子化并以各種電(diàn)荷狀态進行檢測，因此檢測靈敏度低于肽。相比之下，使用(yòng)LC-MS/MS對胰蛋白酶消化獲得的肽片段進行定量的自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更高的檢測靈敏度和良好的選擇性。對于日常的治療藥物(wù)監測，可(kě)以使用(yòng)這三種方法中(zhōng)的任何一種來實現。然而，對于臨床前PK和TK中(zhōng)的少量血樣使用(yòng)實驗動物(wù)進行分(fēn)析，或用(yòng)于監測人體(tǐ)臨床研究中(zhōng)的藥物(wù)消失，需要LLOQ低于1μg/L的更高靈敏度檢測。這種分(fēn)析通常通過自下而上的方法進行。

由于糖鏈結構的多(duō)樣化，色譜圖和MS光譜中(zhōng)都會出現多(duō)個峰，因此Top-down的蛋白質(zhì)組學(xué)方法不适合高靈敏度的生物(wù)分(fēn)析。已經報道利用(yòng)Middle-down蛋白質(zhì)組學(xué)方法将治療性mAb轉化為(wèi)高同質(zhì)性和低分(fēn)子量片段并使用(yòng)高分(fēn)辨率質(zhì)譜法對其進行量化。治療性mAb的IgG用(yòng)IdeS消化以産(chǎn)生F(ab')2和Fc/2片段，用(yòng)還原劑處理(lǐ)F(ab')2裂解二硫鍵并将F(ab')2轉化為(wèi)兩條輕鏈和兩條約25kDa的Fd鏈。使用(yòng)IdeS的Middle-‍‍down蛋白質(zhì)組學(xué)方法用(yòng)于評估抗體(tǐ)的複雜性、長(cháng)期儲存穩定性和治療性mAb制劑的生物(wù)相似性。

下表總結了使用(yòng)Middle-down方法的治療性抗體(tǐ)的應用(yòng)。

Middle-down方法已經廣泛用(yòng)于蛋白質(zhì)組學(xué)及抗體(tǐ)藥物(wù)的表征分(fēn)析。Middle-down方法可(kě)能(néng)是識别和表征蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組的更好選擇，它可(kě)以彌補Bottom-up和Top-down研究的不足，因此它對于實現各種生物(wù)學(xué)目标是必不可(kě)少的。

聯系我們

郵箱：sales@rhinobio.com
電(diàn)話：18912791908

參考文(wén)獻

[1] QI Lian-quan, BAI Yu, LUO Jian-hui. Sequence analysis of therapeutic monoclonal antibody. Acta Pharmaceutica Sinica, 2019, 54(11): 2113-2117.

[2] Pandeswari P B ,Sabareesh V . Middle-down approach: a choice to sequence and characterize proteins/proteomes by mass spectrometry[J]. RSC Advances, 2018, 9(1):313-344.

[3] Todoroki K , Mizuno H , Sugiyama E , et al. Bioanalytical methods for therapeutic monoclonal antibodies and antibody–drug conjugates: A review of recent advances and future perspectives - ScienceDirect[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 179.