自從第一個皮下注射液上市以來，注射熱很(hěn)可(kě)能(néng)是注射的結果。現在，人們将引起恒溫動物(wù)體(tǐ)溫異常升高（發燒、休克或死亡等）的緻熱物(wù)質(zhì)，稱為(wèi)熱原，可(kě)能(néng)是造成大多(duō)數早期發燒和腸外注射描述的其他(tā)附帶生物(wù)效應的原因。熱原包括内毒素和非内毒素熱原(NEP)，細菌内毒素是最常見的熱原，也是醫(yī)藥工(gōng)業界安(ān)全生産(chǎn)所關心的問題。注射時，即使是微量的熱原，也會通過稱為(wèi)Toll樣受體(tǐ)(TLR)的一類蛋白質(zhì)觸發先天免疫反應。TLR是跨膜蛋白，主要在巨噬細胞和樹突狀細胞等所謂的前哨細胞中(zhōng)表達，它們在先天免疫系統的激活中(zhōng)起着至關重要的作(zuò)用(yòng)。它們充當模式識别受體(tǐ)，由對微生物(wù)或病原體(tǐ)相關分(fēn)子模式以及内源性損傷相關分(fēn)子模式的識别觸發。迄今為(wèi)止，已知13種人類TLR，每一種都充當一種或幾種特定配體(tǐ)的受體(tǐ)。這種結合觸發了細胞内信号級聯反應，作(zuò)為(wèi)對潛在有(yǒu)害微生物(wù)或其他(tā)外源性物(wù)質(zhì)的第一反應的基礎（圖1）。

兔熱原測試(RPT)于1942年推出，是第一個也是唯一一個用(yòng)于檢測藥物(wù)和醫(yī)療産(chǎn)品中(zhōng)熱原的體(tǐ)内方法，到目前為(wèi)止，非腸道給藥的産(chǎn)品一般都以這種方式進行測試。RPT存在各種限制，例如：無法區(qū)分(fēn)不同的内毒素和NEP；對疫苗等固有(yǒu)緻熱藥物(wù)的反應隻能(néng)定性；無法應用(yòng)于非靜脈内給藥的藥物(wù)；動物(wù)飼養和用(yòng)于測試所需要投入較多(duō)時間和精(jīng)力；而且最重要的是無法定量分(fēn)析。

基于鲎變形細胞裂解物(wù)（LAL）的内毒素檢測于1977年被美國(guó)FDA批準，之後幾年陸續被其他(tā)主流藥典批準。在藥物(wù)質(zhì)量控制中(zhōng)，有(yǒu)三種主要的LAL方法用(yòng)于檢測和/或定量内毒素，根據它們的檢測機制命名(míng)。雖然它們是不同的方法，但它們都利用(yòng)鲎試劑來檢測内毒素，并依賴于相同的凝血級聯原理(lǐ)（圖2）。凝膠法是最原始的鲎試驗，也是目前藥典認可(kě)内毒素檢測的“金标準”。這是一種定性檢測方法，其中(zhōng)凝膠的凝結表明樣品中(zhōng)存在高于裂解物(wù)靈敏度的内毒素。其他(tā)兩種方法，比濁法和顯色法，都是通過标準曲線(xiàn)實現定量分(fēn)析。比濁法LAL測試将凝膠化速率（濁度）聯系起來，以确定樣品的内毒素濃度。顯色LAL測試使用(yòng)一種合成顯色底物(wù)，該底物(wù)添加到試劑中(zhōng)并被凝血酶激活，從而産(chǎn)生比色讀數。

LAL采用(yòng)海鲎血液作(zuò)為(wèi)生産(chǎn)原料，由于季節、地域等差異，使得LAL的批次差異成為(wèi)常見現象。LAL還含有(yǒu)許多(duō)其他(tā)蛋白質(zhì)（其中(zhōng)至少十種參與抗微生物(wù)反應），這些蛋白質(zhì)可(kě)以抑制或增強活性，例如通過檢測β-葡聚糖和纖維素殘基激活LAL級聯的G因子蛋白。然而，LAL方法的主要限制與其來源有(yǒu)關。該過程需要對動物(wù)鲎進行放血，即使通過采集少量血液便放生和标記，這一過程對動物(wù)來說也并非沒有(yǒu)風險，據統計死亡率可(kě)高達30%以上。除了立法也有(yǒu)明顯的倫理(lǐ)問題外，還有(yǒu)許多(duō)關于這些生物(wù)的長(cháng)期生存能(néng)力的問題，以及由于它們的數量減少導緻的環境問題。

第一個市售的基于重組因子C(rFC)的内毒素檢測方法（BET）于2004年面世（圖2）。從那時起，其他(tā)rFC試劑也逐步進入市場，以提高可(kě)用(yòng)性以及産(chǎn)品和供應商(shāng)的範圍。rFC檢測使用(yòng)單一重組蛋白，因子C和小(xiǎo)熒光肽作(zuò)為(wèi)檢測試劑的一部分(fēn)。與其他(tā)重組生産(chǎn)的産(chǎn)品一樣，其生産(chǎn)标準化主要為(wèi)控制生産(chǎn)相同的rFC蛋白，并且已有(yǒu)實驗證明rFC比LAL批次間的可(kě)重複性高（表1)。另外，rFC檢測也不包含因子G，因此，它可(kě)以避免葡聚糖引起的G因子非特異性幹擾所造成的假陽性。

由于潛在的幹擾，蛋白質(zhì)樣品中(zhōng)内毒素的檢測可(kě)能(néng)具(jù)有(yǒu)挑戰性。輝瑞公(gōng)司2013年利用(yòng)所有(yǒu)市售鲎試劑測試方法（凝膠法、動力學(xué)比濁法、動力學(xué)顯色和終點顯色）以及rFC檢測了13個具(jù)有(yǒu)代表性的生物(wù)蛋白質(zhì)樣品（圖3）。在所有(yǒu)定量分(fēn)析中(zhōng)，10個樣品的内毒素水平都可(kě)測量，rFC和LAL之間的檢測結果差異不大。

裴宇盛等人進行了rFC産(chǎn)品的适用(yòng)性。在四個實驗室的每一個都測試了三批六種不同藥品的适用(yòng)性和幹擾性。六個具(jù)有(yǒu)代表性的品種為(wèi)：抗生素、生化藥物(wù)、重組原藥、中(zhōng)藥注射劑、病毒疫苗和單克隆抗體(tǐ)。研究得出的結論是，rFC對六種藥品具(jù)有(yǒu)良好的适用(yòng)性；所有(yǒu)18批次的加标回收率結果均在中(zhōng)國(guó)藥典要求的50-200%的可(kě)接受範圍内，并滿足幹擾測試要求。研究數據還用(yòng)于支持中(zhōng)國(guó)藥典在其最新(xīn)更新(xīn)中(zhōng)将rFC方法納入BET。

Muroietal，比較了LAL和rFC測定法在具(jù)有(yǒu)複雜基質(zhì)的人體(tǐ)疫苗的内毒素檢測。該研究比較了四種不同的檢測方法：兩種LAL檢測方法和兩種基于rFC的檢測方法。測試的藥品包括：

1）含有(yǒu)蛋白酶的減毒活病毒疫苗；

2）對内毒素檢測沒有(yǒu)幹擾的滅活病毒疫苗；

3）可(kě)能(néng)含有(yǒu)來自其所含革蘭氏陰性抗原的天然内毒素成分(fēn)的一種滅活疫苗；

4）具(jù)有(yǒu)紅色的滅活病毒疫苗，可(kě)能(néng)幹擾經典LAL顯色動力學(xué)測定中(zhōng)的黃色終點判定。

結果表明，基于rFC的内毒素檢測方法适用(yòng)于四種不同基質(zhì)特征的産(chǎn)品中(zhōng)的内毒素檢測。所有(yǒu)方法的參考标準均是要求内毒素(RSE)加标回收率(100EU/ml)在50–200%範圍内。該研究得出結論，LAL和rFC檢測都足以測試和放行四種疫苗産(chǎn)品。

随着科(kē)學(xué)的進步，重組生産(chǎn)的治療性蛋白質(zhì)和肽類藥物(wù)已經系統地取代了動物(wù)提取物(wù)。蛋白質(zhì)的天然提取物(wù)和重組蛋白在功能(néng)、效用(yòng)上的等同性是生物(wù)技(jì )術革命的基礎。因此rFC的發展不是對LAL的挑戰，而是對LAL的傳承與創新(xīn)。另外，rFC法能(néng)夠消除與鲎試劑相關的許多(duō)制約性，例如批次間的變異性；rFC試劑的主要原材料是基因重組表達生産(chǎn)，可(kě)穩定的大批量持久供應，不受天然原材料來源的限制；rFC法的使用(yòng)也符合3R 原則（替換、減少、改進），這将為(wèi)動物(wù)和人類帶來持久的利益。因此未來幾年内，rFC法有(yǒu)望成為(wèi)替代LAL的主流内毒素檢測法而被納入各國(guó)藥典正式方法。

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參考文(wén)獻

[1] Tindall,B.,Demircioglu, D., & Uhlig, T. (2021). Recombinant bacterial endotoxin testing: a proven solution. BioTechniques, 70(5), 290-300.