背景：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包含去除所有(yǒu)N-連和相對簡單O-連聚糖所需要的酶及試劑。其中(zhōng)的酶試劑是三種糖苷酶的混合物(wù)，包括PNGase F、O-Glycosidase、α2-3.6.8.9Neuraminidase。該試劑盒包含的所有(yǒu)酶及試劑均與下遊HPLC及MS兼容。PNGase F是從糖蛋白中(zhōng)特異性除去N-連聚糖的糖苷内切酶，能(néng)夠将絕大多(duō)數N-糖鏈（除最内測GlcNac上連有(yǒu)α-1,3岩藻糖殘基，常見于植物(wù)及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分(fēn)子上釋放下來，可(kě)以在N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和複雜寡糖部分(fēn)最内側的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1。

圖1. PNGase F可(kě)以從糖蛋白或糖肽上切割釋放幾乎所有(yǒu)類型的N-連糖鏈

       但是對于O-連聚糖，由于沒有(yǒu)一種像PNGase F的“通用(yòng)”糖苷内切酶，必須通過一系列糖苷酶除去單糖。Rhinogen^® O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用(yòng)于糖蛋白唾液酸修飾的O-連糖鏈的酶切釋放，Rhinogen^®α2-3,6,8,9 Neuraminidase能(néng)夠釋放O-連糖鏈非還原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸殘基。在去除末端唾液酸殘基的修飾後，Rhinogen^® O-Glycosidase能(néng)夠将糖蛋白中(zhōng)Ser或Thr殘基的羟基連接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-連雙糖釋放下來，如圖2。

圖2. Rhinogen^® O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用(yòng)于常見二或三唾液酸修飾的O-連糖鏈的酶切釋放

包裝(zhuāng)規格：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包裝(zhuāng)規格如下：

配套試劑：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)配套提供的試劑如下：

       本試劑盒中(zhōng)的所有(yǒu)酶都是大腸杆菌BL21中(zhōng)表達并分(fēn)離純化的重組酶：PNGase F 基因來源于Flavobacterium meningsepticum，分(fēn)子量為(wèi)36kDa；O-Glycosidase基因來源于Enterococcus Faecalis，分(fēn)子量為(wèi)147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因來源于Arthrobacter ureafaciens，分(fēn)子量為(wèi)66KDa。

産(chǎn)品質(zhì)量：

       SDS-PAGE分(fēn)析，純度≥95%；沒有(yǒu)檢測到污染的外切糖苷酶、内切糖苷酶及蛋白酶活性。

酶活定義：

      1個PNGase F酶活力單位定義：在10 μl反應體(tǐ)系中(zhōng)，37°C，pH7.5條件下，1小(xiǎo)時内催化釋放10μg變性RNase B＞95%N-連寡糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® PNGase F=1 unit NEB PNGase F。

      1個O-Glycosidase酶活力單位定義：在100 μl反應體(tǐ)系中(zhōng)，37°C，pH7.5條件下，1小(xiǎo)時内從5mg唾液酸酶消化後的非變性fetuin 上催化釋放0.68nmol O-連二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

      1個α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力單位定義：在37°C，pH5.5條件下，以對硝基苯基-α-D-N-乙酰神經氨酸為(wèi)底物(wù)，1分(fēn)鍾内催化釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^® Sialidase ATM。

儲存條件：

       采用(yòng)冰袋運輸，收到産(chǎn)品後請立即将酶置于4℃，嚴禁凍存；配套試劑置于-20℃儲存。本品不含防腐劑，務(wù)必确保無菌操作(zuò)取用(yòng)，避免污染。

産(chǎn)品特點：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)具(jù)有(yǒu)穩定性高、比活性高等特點，是三種高度純化和非常穩定的糖苷内切酶的組合，适用(yòng)于蛋白質(zhì)組學(xué)及糖生物(wù)學(xué)研究中(zhōng)糖蛋白上所有(yǒu)N-連聚糖及常見相對簡單O-連聚糖的有(yǒu)效釋放。

       1. 高純度：沒有(yǒu)污染蛋白酶/其它糖苷酶，純度≥95％；

       2. 高穩定性：每批KitⅡ試劑盒中(zhōng)酶及試劑都經過嚴格的質(zhì)量控制，以實現高穩定性；

       3. 高比活性：有(yǒu)效和完全的釋放所有(yǒu)N-連聚糖及常見O-連聚糖；

       4. HPLC、MS兼容：試劑盒中(zhōng)所有(yǒu)的酶及試劑與下遊HPLC及MS兼容。 

應   用(yòng)：

       1. 聚糖結構分(fēn)析;

       2. 結合位點及功能(néng)分(fēn)析;

       3. 治療性糖蛋白的表征及質(zhì)量控制;

       4. 蛋白質(zhì)組學(xué)分(fēn)析，消除糖蛋白的異質(zhì)性。

使用(yòng)建議：

       1、變性條件下去糖基化方案：

       1）取10-100µg糖蛋白溶液，加入3µl 10×Denaturing緩沖液，補加純化水使得反應體(tǐ)系為(wèi)30µl；

       2）将上述30µl體(tǐ)系100℃處理(lǐ)10min，使糖蛋白完全變性；

       3）室溫冷卻5min；

       4）在上述變性體(tǐ)系中(zhōng)，分(fēn)别加入5µl 10×Glyco緩沖液2、5µl 10% NP-40溶液、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體(tǐ)積為(wèi)50μl，輕柔混勻；

       5）37°C 條件下反應1-5hr；

       注意：大多(duō)數糖蛋白樣品在37°C 條件下反應1-5hr後能(néng)夠被完全去糖基化；然而對于一些複雜的糖蛋白樣品可(kě)能(néng)需要延長(cháng)反應時間。

       2、非變性條件下去糖基化方案：

       1）取10-100µg糖蛋白溶液，加入5μl 10×Glyco緩沖液2、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體(tǐ)積為(wèi)50μl，輕柔混勻；

       2）37°C 條件下反應4-24hr；

       注意：當對天然糖蛋白去糖基化時，建議将等量糖蛋白樣品進行變性後再同步進行酶切去糖基化實驗作(zuò)為(wèi)陽性對照，以确定非變性條件下去糖基化反應的程度。

操作(zuò)說明：

       1. 上述操作(zuò)方法旨在為(wèi)Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)作(zuò)為(wèi)去糖基化試劑操作(zuò)的一般指南，對于不同的糖蛋白樣品，去糖基化活性高度依賴于反應條件，建議進行适當優化或根據經驗确定最優的操作(zuò)方法；

       2. 反應體(tǐ)系可(kě)以線(xiàn)性放大或縮小(xiǎo)；

       3. 本産(chǎn)品适用(yòng)于天然或者變性糖蛋白，當變性時，大多(duō)數糖蛋白能(néng)更有(yǒu)效地去糖基化。對于天然糖蛋白的去糖基化，可(kě)能(néng)需要更多(duō)的酶及更長(cháng)的反應時間；

       4. 變性及非變性條件下的去糖基化處理(lǐ)方案得到的樣品均與下遊質(zhì)譜兼容；

       5. Fetuin可(kě)用(yòng)作(zuò)有(yǒu)效的陽性對照。試劑盒提供的Fetuin濃度為(wèi)10mg/ml；

       6. 本試劑盒不建議用(yòng)于粘蛋白樣底物(wù)（Mucin-like substrates）的去糖基化；

       7. 本産(chǎn)品僅供研究使用(yòng)，不适用(yòng)于人或動物(wù)診斷或治療用(yòng)途。