背景：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包含O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase，二者均是重要的糖基化研究的工(gōng)具(jù)酶，組合用(yòng)于糖蛋白O-連糖鏈的酶切釋放。Rhinogen^® O-Glycosidase能(néng)夠将糖蛋白中(zhōng)Ser或Thr殘基的羟基連接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-連雙糖釋放下來，如圖1。核心結構的任何修飾都可(kě)以阻斷O-Glycosidase的作(zuò)用(yòng)，最常見的修飾是核心結構的單、二或三唾液酸化。Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase能(néng)夠釋放O-連糖鏈非還原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸殘基，如圖2，不同唾液酸殘基的釋放速率大緻為(wèi)α (2,6)-＞α (2,3)- ＞α (2,8)- ＞α (2,9)-。唾液酸酶的這種組合模式使得O-連糖鏈的酶切釋放更徹底。該Kit包含的所有(yǒu)酶及試劑均與下遊HPLC及MS兼容。

圖1. O-Glycosidase與α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用(yòng)于糖蛋白O-連糖鏈的酶切釋放

圖2. Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase作(zuò)用(yòng)位點

包裝(zhuāng)規格：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包裝(zhuāng)規格如下：

配套試劑：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)提供的配套試劑如下：

産(chǎn)品來源：

       本試劑盒中(zhōng)的所有(yǒu)酶都是大腸杆菌BL21中(zhōng)表達并分(fēn)離純化的重組酶：O-Glycosidase基因來源于Enterococcus Faecalis，分(fēn)子量為(wèi)147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因來源于Arthrobacter ureafaciens，分(fēn)子量為(wèi)66KDa。

産(chǎn)品質(zhì)量：

       SDS-PAGE分(fēn)析，純度≥95%；沒有(yǒu)檢測到污染的糖苷外切酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

酶活定義：

       1個O-Glycosidase酶活力單位定義：在100 μl反應體(tǐ)系中(zhōng)，37°C，pH7.5條件下，1小(xiǎo)時内從5mg唾液酸酶消化後的非變性fetuin 上催化釋放0.68nmol O-連二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

       1個α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力單位定義：在37°C，pH5.5條件下，以對硝基苯基-α-D-N-乙酰神經氨酸為(wèi)底物(wù)，1分(fēn)鍾内催化釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^® Sialidase ATM。

儲存條件： 

       -20°C。

産(chǎn)品特點：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具(jù)有(yǒu)穩定性高、比活性高等特點，是兩種高度純化和非常穩定的糖苷酶的組合，适用(yòng)于蛋白質(zhì)組學(xué)及糖生物(wù)學(xué)研究中(zhōng)糖蛋白上常見O-連聚糖的有(yǒu)效釋放。

1. 高純度：沒有(yǒu)污染蛋白酶/其它糖苷酶，純度≥95％；

2. 高穩定性：每批Kit試劑盒中(zhōng)酶及試劑都經過嚴格的質(zhì)量控制，以實現高穩定性；

3. 高比活性：有(yǒu)效釋放糖蛋白上唾液酸修飾O-連聚糖；

4. HPLC、MS兼容：試劑盒中(zhōng)所有(yǒu)的酶及試劑與下遊HPLC及MS兼容。

應用(yòng)：

1. 聚糖結構分(fēn)析;

2. 結合位點及功能(néng)分(fēn)析;

3. 治療性糖蛋白的表征及質(zhì)量控制;

4. 蛋白質(zhì)組學(xué)分(fēn)析，消除糖蛋白的異質(zhì)性。

使用(yòng)建議：

       變性條件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白溶液，加入1µl 10×Denaturing緩沖液，補加純化水使得反應體(tǐ)系為(wèi)10µl；

2. 将上述10µl體(tǐ)系100℃處理(lǐ)10min，使糖蛋白完全變性；

3. 室溫冷卻5min；

4. 在上述變性體(tǐ)系中(zhōng)，分(fēn)别加入2µl 10×Glyco緩沖液2、2µl 10% NP-40溶液、1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體(tǐ)積為(wèi)50μl，輕柔混勻；

5. 37°C 條件下反應1-5hr；

注意：對于不同的糖蛋白樣品，需要實驗摸索最适的酶濃度及反應時間。

       非變性條件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白底物(wù)溶液，加入2µl 10×Glyco緩沖液2、純化水及1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，使得總反應體(tǐ)積為(wèi)20µl，輕柔混勻；

2. 37°C 條件下反應1-4hr。

注意：通常情況下，糖蛋白變性與否不顯著影響O-連糖鏈去除的效率，但也不排除個例，建議根據自己的底物(wù)特性，選擇合适的方法。

當對天然糖蛋白去糖基化時，建議将等量糖蛋白樣品進行變性後再同步進行酶切作(zuò)為(wèi)陽性對照，以确定非變性條件下去糖基化反應的程度。

操作(zuò)說明：

1. 上述操作(zuò)方法旨在為(wèi)Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)作(zuò)為(wèi)去糖基化試劑操作(zuò)的一般指南，對于不同的糖蛋白樣品，去糖基化活性高度依賴于反應條件，建議進行适當優化或根據經驗确定最優的操作(zuò)方法；

2. 去糖基化體(tǐ)系可(kě)以線(xiàn)性放大或縮小(xiǎo)；

3. 由于變性緩沖液中(zhōng)含有(yǒu)SDS，而SDS會抑制Rhinogen^® O-Glycosidase的活性，因此在變性糖蛋白反應體(tǐ)系中(zhōng)需加入終濃度為(wèi)1%的NP-40，其能(néng)有(yǒu)效解除SDS對O-Glycosidase酶活的抑制；

4. 本産(chǎn)品适用(yòng)于天然或者變性糖蛋白，對于天然糖蛋白的去糖基化，可(kě)能(néng)需要更多(duō)的酶及更長(cháng)的反應時間；

5. EDTA、對氯丙基苯磺酸、Mn²⁺、Zn²⁺對O-Glycosidase的酶活有(yǒu)一定的抑制作(zuò)用(yòng)，1mM各物(wù)質(zhì)存在條件下，酶活回收率分(fēn)别為(wèi)63%、60%、44%、66%%；

6. 本産(chǎn)品僅供研究使用(yòng)，不适用(yòng)于人或動的物(wù)診斷及治療用(yòng)途。