背景：
科(kē)學(xué)研究表明，人體(tǐ)中(zhōng)存在的蛋白質(zhì)超過50%是以糖蛋白的形式存在。蛋白質(zhì)糖基化作(zuò)為(wèi)生物(wù)體(tǐ)内最重要的蛋白質(zhì)翻譯後修飾形式之一，具(jù)有(yǒu)重要的生物(wù)學(xué)功能(néng)，不僅影響蛋白質(zhì)的空間構象、生物(wù)活性、運輸及定位等，而且還參與分(fēn)子識别、細胞通信、細胞分(fēn)化、信号轉導、免疫應答(dá)等等在内的各種重要生命活動。在多(duō)種疾病，如腫瘤（FDA已批準的用(yòng)于癌症疾病診斷和監控的生物(wù)标志(zhì)物(wù)中(zhōng)大部分(fēn)是糖蛋白）、神經退行性疾病、心血管病、代謝(xiè)性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的發生發展中(zhōng)均伴随着蛋白質(zhì)糖基化程度及糖鏈結構異常的發生。此外，糖基化還顯著影響生物(wù)治療劑的生物(wù)活性、靶标、運輸、血清半衰期、清除率及受體(tǐ)識别等性質(zhì)。例如，重組促紅細胞生成素的藥代動力學(xué)和效力受其糖基化狀态的嚴重影響，而單克隆抗體(tǐ)通過ADCC介導功效的能(néng)力受Fc區(qū)岩藻糖含量的影響，因此蛋白質(zhì)糖基化研究是繼核酸、蛋白質(zhì)之後生命科(kē)學(xué)中(zhōng)又(yòu)一極具(jù)潛力的研究領域，具(jù)有(yǒu)重要理(lǐ)論及應用(yòng)意義。FDA要求所有(yǒu)類型的糖蛋白都需要進行糖型分(fēn)析。
來源于Flavobacterium meningsepticum的肽N-糖苷酶F（PNGase F，EC 3.5.1.52）是從糖蛋白中(zhōng)特異性除去N-連聚糖的糖苷内切酶，是一類重要的糖基化研究的工(gōng)具(jù)酶，被廣泛用(yòng)于治療性蛋白質(zhì)上N-連糖鏈位點、結構信息及功能(néng)關系的研究。Rhinogen® PNGase F (Glycerol-free)是表達于大腸杆菌 BL21中(zhōng)的重組PNGase F，能(néng)夠将絕大多(duō)數N-糖鏈（除含α-1,3連接的核心岩藻糖，常見于植物(wù)及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分(fēn)子上釋放下來，可(kě)以在 N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和複雜寡糖部分(fēn)最内側的 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1A。在釋放糖鏈的同時将氨基酸特征序列上的天冬酰胺殘基轉化為(wèi)天冬氨酸殘基，其賦予蛋白質(zhì)+ 1Da質(zhì)量變化，如圖1B。它對多(duō)種底物(wù)具(jù)有(yǒu)高度活性，包括純化的糖蛋白和人血清糖蛋白的複合混合物(wù)。此外，由于不含甘油，在非變性條件下，酶與HPLC及質(zhì)譜工(gōng)作(zuò)流程環境兼容。連接到N-連寡糖的磷酸鹽，硫酸鹽和唾液酸基團不影響N-糖鏈的釋放。
圖1A. PNGase F切割位點
圖1B. PNGase F釋放糖鏈的反應機制[15]
産(chǎn)品包裝(zhuāng)：
Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin包裝(zhuāng)規格如下：
目錄号
組成
QPF-101-A
1支
QPF-101-B
5支
QPF-101-C
10支
一支Immobilized PNGase F，Microspin可(kě)用(yòng)于0.2mg糖蛋白的N-聚糖去除。
儲存體(tǐ)系：
産(chǎn)品儲存于20%乙醇中(zhōng)，不添加防腐劑。
配套試劑：
試劑
成分(fēn)
10×Denaturing緩沖液
5%SDS, 0.4M DTT
10×Glyco緩沖液2
0.5M Sodium Phosphate (pH7.5 at 25°C)
10%NP-40溶液
10%NP-40
産(chǎn)品特性：
Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin适用(yòng)于蛋白質(zhì)組學(xué)及糖生物(wù)學(xué)研究中(zhōng)糖蛋白上N-連寡糖鏈的有(yǒu)效釋放，具(jù)有(yǒu)如下特性：
1. 高穩定性：每批産(chǎn)品都經過嚴格的質(zhì)量控制，以實現産(chǎn)品批間穩定性；
2. 高比活性：有(yǒu)效和完全的釋放N-連聚糖；
3. 與下遊HPLC、質(zhì)譜兼容：不含甘油，酶切體(tǐ)系與HPLC及質(zhì)譜工(gōng)作(zuò)流程環境兼容。
保藏條件：
采用(yòng)冰袋運輸，收到産(chǎn)品後請立即将酶置于4℃，嚴禁凍存；配套試劑置于-20℃儲存。本品不含防腐劑，務(wù)必确保無菌操作(zuò)取用(yòng)，避免污染。
應用(yòng)：
1. 從糖肽及糖蛋白上釋放完整的N-連聚糖；
2. 表征蛋白質(zhì)是否糖基化；
3. 用(yòng)于分(fēn)子量檢測或晶體(tǐ)學(xué)研究時去糖基化蛋白質(zhì)的制備；
4. N-糖基化糖蛋白的結構-功能(néng)研究；
5. 糖基化位點的确定。
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PNGase F 去糖基化後得到什麽産(chǎn)物(wù)？ |
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利用(yòng) Rhinogen® PNGase F(Glycerol-free)進行糖蛋白去糖基化後，會釋放出完整的寡糖鏈，并在釋放糖鏈的同時将氨基酸特征序列上的天冬酰胺殘基轉化為(wèi)天冬氨酸殘基。 |
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為(wèi)什麽蛋白被降解了？是否可(kě)以在 PNGase F 去糖基化反應體(tǐ)系中(zhōng)加入蛋白酶抑制劑？ |
| 蛋白酶會幹擾去糖基化實驗的結果，當蛋白質(zhì)處于變性狀态時，它更容易被蛋白酶切割。下列蛋白酶抑制劑中(zhōng)的任何一種均可(kě)用(yòng)于 Rhinogen® PNGaseF(Glycerol-free)去糖基化反應體(tǐ)系中(zhōng)：抑肽酶 （終濃度 10μg/ml）苄脒（終濃度 1mM）胃蛋白酶抑制劑（終濃度 10μg/ml）亮肽素（終濃度 1μM）EGTA（終濃度 1mM）EDTA（終濃度 1mM）各種蛋白酶抑制劑建議配制成 1000×的濃縮母液，胃蛋白酶抑制劑溶解在甲醇溶液中(zhōng)，其餘抑制劑均溶解在水中(zhōng)。 |
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| PNGase F 在含有(yǒu)尿素的反應體(tǐ)系中(zhōng)是否可(kě)以正常使用(yòng)? |
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有(yǒu)文(wén)獻報道，PNGase F在37℃條件下，在2.5M尿素溶液中(zhōng)可(kě)以穩定24hr，在5M尿素溶液中(zhōng)可(kě)以保留40％的活性[16]。因此反應體(tǐ)系中(zhōng)存在較低濃度的尿素可(kě)能(néng)不影響Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin去糖基化的活性。 |
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對于天然糖蛋白，我應該去除糖蛋白上的寡糖鏈？ |
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當糖蛋白不用(yòng)SDS變性時，由于空間位阻效應（二級和三級蛋白質(zhì)結構），Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin相對很(hěn)難到達寡糖鏈的切割位點。在酶用(yòng)量固定的基礎上，更長(cháng)的反應時間有(yǒu)助于提高酶去除寡糖鏈的效率，但每種糖蛋白都有(yǒu)其特異性，必須根據實驗或者經驗确定。 |
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表面活性劑是否會抑制外切糖苷酶/糖苷内切酶活性? |
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離子及非離子型表面活性劑在0.5-1.0%濃度範圍時，大多(duō)數糖苷酶都不受或受到較小(xiǎo)影響。但PNGase F、O-Glycosidase 及 β1 -4 Galactosidase 這3種酶會受SDS的抑制，必須加入1%終濃度的NP-40到反應混合物(wù)中(zhōng)才能(néng)解除抑制。 |
說明書
COAs
MSDS